病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-02-15; 11(2): 157-160
在线出版日期: 2003-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i2.157
IRES特异性IRNA对HCV IRES启动蛋白翻译细胞内抑制作用
梁雪松, 连建奇, 周永兴, 聂青和, 郝春秋
梁雪松, 连建奇, 周永兴, 聂青和, 郝春秋, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心 陕西省西安市 710038
梁雪松, 女, 1970-12-03生, 汉族, 医学博士, 主治医师. 山西省和顺县人.
基金项目: 国家自然科学基金课题, No. 3000147.
通讯作者: 连建奇, 710038, 陕西省西安市新寺街1号, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心. lianjq@yahoo.com
电话: 029-3377595
收稿日期: 2002-10-25
修回日期: 2002-11-01
接受日期: 2002-11-20
在线出版日期: 2003-02-15

目的: 研究核糖体内部进入位点(internal ribosome entry site, IRES)特异性抑制性RNA (inhibitor RNA, IRNA)细胞内对丙型肝炎病毒(HCV) IRES介导蛋白翻译的抑制作用.

方法: 体外应用脂质体细胞转染法, 将IRNA及其突变体mIRNA真核表达载体pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA转染人肝癌细胞株(HHCC), 经G418筛选4 wk后建立IRNA及mIRNA表达株; 以相同的方法构建pcHCVcluc转染株; 以脂质体介导细胞转染法将pCMVNCRLuc转染IRNA及mIRNA细胞株, 于转染后48 h检测荧光素酶表达量; 将IRNA及mIRNA真核表达体转染pcHCVcLuc表达株, 于转染后不同时间检测荧光素酶表达量.

结果: HCV IRES介导蛋白翻译在IRNA表达株明显受到抑制, 同样IRNA对HCV翻译复制子的蛋白翻译作用有明显抑制性; 突变体mIRNA表达株和空载体对照株中未见相似的抑制性.

结论: pcHCVcluc在HHCC细胞中获得有效表达; IRES特异性IRNA能有效的抑制HCV IRES介导细胞内蛋白翻译作用.

关键词: N/A
引文著录: 梁雪松, 连建奇, 周永兴, 聂青和, 郝春秋. IRES特异性IRNA对HCV IRES启动蛋白翻译细胞内抑制作用. 世界华人消化杂志 2003; 11(2): 157-160
Inhibitory effect of IRES specific inhibitor RNA on HCV IRES mediated protein translation
Xue-Song Liang, Jian-Qi Lian, Yong -Xing Zhou, Qin-He Nie, Chun-Qiu Hao
Xue-Song Liang, Jian-Qi Lian, Chun-Qiu Hao, Yong-Xing Zhou, Qing-He Nie, The Center of Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases of PLA, Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
Supported by: National Nature Science Foundation of China, No. 3000147.
Correspondence to: Dr Jian-Qi Lian, The center of diagnosis and treatment of infectious diseases of PLA, Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China. lianjq@yahoo.com
Received: October 25, 2002
Revised: November 1, 2002
Accepted: November 20, 2002
Published online: February 15, 2003

AIM: To explore the inhibitory effect of internal ribosome entry site (IRES) specific inhibitor RNA (IRNA) on HCV IRES mediated protein translation in vivo.

METHODS: Human hepatic carcinoma cell line (HHCC) was transfected with the eukaryotic vectors of IRNA or mIRNA (pcRz-IRNA or pcRz-mIRNA), and then selected with G418 for 4 weeks. HHCC expressing IRNA or mIRNA was cotransfected with pCMVNCRluc containing HCV IRES. HHCC stably expressing pcHCVcluc was transfected with pcRz-IRNA, and pcRz-mIRNA, respectively, the luciferase activity was examined at desired time post-transfection.

RESULTS: The pCMVNCRluc was efficiently suppressed in HHCC expressing IRNA rather than the cell line expressing mIRNA. The IRES specific IRNA inhibited expression of HCV IRES mediated luc gene by 20% to 80% in pcHCVcluc expressing cell after transfection; However, no inhibitory effect of the mutant IRNA was observed.

CONCLUSION: pcHCVcluc could be expressed successfully in HHCC, and IRNA inhibited HCV IRES mediated gene expression in vivo.

Key Words: N/A
0 引言

随着丙型肝炎病毒感染的蔓延[1-24], 治疗方法的研究成为目前研究的热点[25], 尤其是近年有关基因治疗的研究更是日新月异[26-33]. HCV 5'非编码区(NCR)含有-富含嘧啶区即IRES区, 该区的完整性和稳定性对病毒蛋白翻译和核酸复制至关重要. 基于其结构的重要性而成为目前基因治疗的主要靶位点[34]. 我们对IRES特异性IRNA及其突变体mIRNA对HCV IRES介导报道基因荧光素酶细胞内表达量的抑制活性进行了初步研究.

1 材料和方法
1.1 材料

质粒pcRz-IRNApcRz-mIRNA为本研究室构建保存, 该质粒在多克隆位点内含有两个具有自剪切作用的顺式核酶及IRNA/mIRNA; 质粒pCMVNCRluc由德国Alt教授惠赠, 含HCV 5'NCR基因和66 nt的C区基因, 与荧光素酶基因(luciferase, luc)融合, 可通过检测luc活性间接反应HCV 5'NCR的功能. pcHCVcluc由本研究室构建保存, 含HCV IRES及核心抗原部分编码序列. 人肝癌细胞系(HHCC)为本室保存株. 脂质体转染试剂及1 640培养基、新生牛血清为Gibico公司产品. 荧光素酶及b乳糖酶检测试剂盒为Promega产品.

1.2 方法

用含100 mL/L新生小牛血清的RPMI 1 640培养液, 加青链霉素, 在37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养. 建立 IRNA及mIRNA表达株和HCV IRES介导蛋白翻译细胞株: 6孔板中传单层HHCC培养至密度为0.06-0.08.准备A液: 无血清1 640培养液250 μL中加10 μg pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA或pcHCVcluc. 准备B液: 脂质体12 μL与无血清1 640培养液250 μL混合, 混匀A、B液, 室温静置20 min, 然后补足无血清1 6401 mL, 加于待转染细胞上, 37℃, 50 μL/L CO2, 培养17 h, 更换完全培养液, 培养48 h细胞形态好转后更换含G418 200 mg/L选择培养基, 继续培养4 wk至细胞形成单克隆, 并继续传代培养. 质粒转染: pCMVNCRluc 5 μg、pSV40-bgal 5 μg共转染表达IRNA或mIRNA细胞株, 于转染后48 h收获细胞裂解液进行荧光素酶活性检测; pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA/pcDNA3 10 μg转染pcHCVcluc转染株, 于转染后不同时间检测荧光素酶表达量. 用荧光素酶检测试剂盒(Promega)于TD-20/20发光仪上检测荧光素酶活性; 用β-Gal活性检测试剂盒(Promega)于可见-紫外分光光度仪上检测β-Gal浓度. 荧光素酶表达量以荧光素酶活性单位(IU)/β-Gal浓度(U)表示, 抑制率 = 1-实验孔荧光素酶表达量/对照孔荧光素酶表达量×100%. 转染细胞玻片上生长、固定, 抗HCV C单克隆抗体稀释液均匀滴于细胞玻片, 放于湿盒, 37℃温育1h; 取出后PBS缓冲液振洗3次, 10min/次; 0.1g/L伊文氏兰配制的PBS与FITC标记二抗10: 1稀释后均匀滴于玻片上, 放入湿盒, 37℃温育1 h; PBS缓冲液振洗3次, 10 min/次, 500 mL/L甘油缓冲液封片.

2 结果
2.1 荧光素酶基因在HHCC中表达

pCMVNCRluc为-瞬时表达载体, 当转染于HHCC细胞后, 表达荧光素酶的活性随转染后时间的延长而下降. 因此, 我们分别于转染后2 d、3 d、4 d、7 d和10 d收集细胞, 裂解保留上清液, 检测荧光素酶活性. 结果证实, 该载体在转染HHCC细胞后可有效表达, 转染后2 d的活性最高, 4 d时荧光素酶活性明显下降, 于10 d时将为本底水平(图1).

图1
图1 pCMVNCRluc在HHCC中的表达.
2.2 HCV IRES介导荧光素酶基因在IRNA/mIRNA表达株中的表达

将含HCV IRES的瞬时表达载体pCMVNCRluc与转染效率控制载体pSV 40-β gal共转染IRNA/mIRNA表达株及空载体pcDNA3株和空白HHCC株, 于转染后48 h时检测荧光素酶活性, 并以抑制率表示.

IRNA的活性. 检测结果示, 在IRNA表达株中由HCV IRES介导的荧光素酶表达量同对照组相比明显下降, 在荧光素酶表达最高的转染后48 h时, 抑制率达到80%, 而在mIRNA表达株中及空载体对照株中却仅有不到5%的抑制率. 同时进行的由帽状结构介导的荧光素酶表达量在3种细胞株中同空白组相比抑制率均低于5%(图2).

图2
图2 HCV IRES介导荧光素酶基因在IRNA表达株中的表达.
2.3 pcHCVcluc在HHCC中的表达

质粒转染并经G418筛选4 wk后, 转染HHCC细胞形成单克隆, 进一步传代培养后用间接免疫荧光检测HCV核心抗原. 同未转染细胞相比, pcHCVcluc在HHCC中获得稳定表达(图3).

图3
图3 pcHCVc-luc在人肝癌细胞株HHCC中稳定表达免疫荧光鉴定.
2.4 IRNA及mIRNA在pcHCVcluc细胞表达株中的表达

IRNA在转染pcHCVcluc细胞表达株后24 h时, 由HCVIRES介导的荧光素酶表达量同未转染IRNA株相比下降15%左右, 随着时间的延长IRNA对HCV IRES介导的荧光素酶表达量抑制性增加, 在转染后72 h时达到最大80%, 在转染后7 d时转染效率仍为80%. 同时转染的mIRNA和空载体pcDNA3未见对HCV IRES介导荧光素酶具抑制活性(图4).

图4
图4 IRNA及mIRNA在pcHCVcluc细胞表达株的表达.
3 讨论

在全世界范围内HCV感染人数达到1.7亿人左右, 成为严重威胁着人类健康和生活质量的疾病之一 . 然而, 目前抗HCV感染的主要药物α-干扰素疗效有限, 且副反应较多不易耐受. 因此有必要寻找更有效的治疗途径. HCV为-单链正股RNA病毒, 含有一个开放读码框(ORF). HCV5'端含有-长的非编码区, 且该区具有多个起始密码子(AUG)和明显的空间结构, 这种结构同脊髓灰质炎病毒和EMCV等的IRES结构相似[32-34]. 研究证实, HCV IRES区在HCV基因复制和蛋白翻译过程中具有重要的作用, 因而该区成为抗HCV感染治疗的重要靶位之一. 近年已经在体内外研究中证实, 针对HCV IRES区的反义核酸和核酶能明显的抑制病毒蛋白翻译和核酸复制[35-37].

HCV IRES介导蛋白翻译过程中一些宿主细胞因素同IRES功能相关. 这些因素的作用主要是促进IRES与核糖体结合从而增强病毒蛋白翻译功能. 目前已经证实的宿主蛋白包括聚嘧啶束蛋白(PTB)、La蛋白及核仁素等[38]. 这些发现可激发人们发现新的抗病毒感染策略. 在1992年时, Coward et al偶然反现在酿酒酵母中脊髓灰质炎病毒IRES介导蛋白翻译受到抑制, 原因是由于-长60 nt的RNA片段, 并命名为抑制性RNA(IRNA). 此后, 在体外实验中证实IRNA对HCV IRES介导蛋白翻译具有抑制作用, 且IRNA作用机制是通过与宿主因素La抗原等相结合而发挥作用的[39]. 我们在体外化学合成IRNA互补cDNA并应用能量级最低原则建立了其突变体, 成功建立了在IRNA和mIRNA两端引入具自剪切作用顺式核酶的原核表达载体, 并于体外实验证实IRNA对HCV IRES介导蛋白翻译具有抑制作用. 为了进一步研究其对HCVIRES介导蛋白翻译的体内抑制性, 我们用含HCV IRES的瞬时表达载体转染IRNA及mIRNA表达细胞株, 结果提示IRNA在细胞内同样具有抑制HCV IRES介导蛋白翻译作用, 而mIRNA却完全失去了抑制活性. 在此基础上我们进一步证实, 由HCV IRES介导的报道基因荧光素酶表达量同对照组和空载体对照组相比明显受到抑制, 而在基本结构明显改变的mIRNA株却未见有明显的减少.

为了排除非特异性短片段RNA对HCV IRES介导蛋白表达的影响, 我们在实验中同时将靶基因pCMVNCRluc转染空载体(pcDNA3)细胞株, 结果证实非特异性短片段RNA对HCV IRES介导蛋白翻译无明显的抑制作用. 同空白对照相比空载体株和mIRNA表达株蛋白表达量均有轻度下降(抑制率5%左右), 这可能是由于转染并经G418筛选后细胞活性较空白细胞株相比较差. 此外, 为了排除转染效率的影响, 我们应用靶基因和转染效率控制载体共转染靶细胞, 并应用荧光素酶活性(IU)/β牛乳糖酶活性(U)表示HCV IRES介导荧光素酶表达量. Das et al应用相似的研究方法得到了相同的研究结果. 我们的研究结果提示, pcDNA-luc转染IRNA表达株后, 荧光素酶表达量未受到明显的抑制, 这提示IRNA对由帽状结构依赖性方式进行的蛋白翻译无抑制活性. 别的学者研究中得到了相似的结果, 并且他们还证实IRNA对宿主细胞蛋白翻译无影响, 这为其进一步的抗HCV治疗应用奠定了基础[40]. 本研究中反过来将IRNA表达体转染含HCV IRES的pcHCVcluc细胞表达株, 结果是在IRNA转染后24 h是荧光素酶表达量就被抑制, 到转染后72 h时抑制率达最高(80%左右), 而转染后7 d时抑制率并未见提高, 这-结果提示IRNA并不能完全阻断HCV IRES介导的蛋白翻译.

编辑: N/A

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