MDM2基因扩增和蛋白表达与胃癌相关性的研究

摘要

目的

研究癌基因mdm2在胃癌中的基因扩增和蛋白表达状况, 揭示mdm2与胃癌发生发展的相关性.

方法

用RT-PCR和Westernblot方法对胃癌细胞在mRNA、蛋白质水平上进行检测.

结果

mdm2的基因扩增阳性率在胃癌组织中较高, 其中低分化12.5％、中分化37.5％、高分化87.5％, 与正常组织比较有显著性差异(P<0.05), 且与病理分级有关(P<0.05). mdm2的蛋白表达阳性率在胃癌组织中较高, 其中低分化25％、中分化37.5％、高分化62.5％, 与正常组织比较有显著性差异(P<0.05), 与病理分级无关(P>0.05).

结论

mdm2的基因扩增和蛋白过表达参与胃癌的发生发展, 检测胃癌mdm2基因扩增对估计该肿瘤的预后可能有所帮助.

关键词: N/A

N/A

N/A

Corresponding author: N/A

Received: January 18, 2003
Revised: February 10, 2003
Accepted: March 28, 2003
Published online: November 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

胃癌是危害人类健康的主要恶性肿瘤之一, 基因异常表达是肿瘤发生的重要原因. 我们收集不同病理分类的胃癌标本, 检测mdm2在胃癌组织中的基因水平和蛋白表达, 进而分析mdm2与胃癌发生、发展及预后的关系, 为临床治疗胃癌提供分子生物学方面的依据.

1 材料和方法

1.1 材料

标本来源: 中国医科大学附属第二医院胃镜室及一院肿瘤外科手术胃癌标本, 取高分化、中分化、低分化各8例. 取6例正常胃窦组织为对照组. 主要试剂: MDM2抗体为美国Neomarkers公司产品; ECL (enhanced chemiluminescence, ECL)试剂盒为美国Santa Cruz公司产品; RNA提取试剂TRIzol购自Invetrogen公司; PCR试剂盒为TAKARA公司产品; RT-PCR引物由上海生物工程公司合成.

1.2 方法

1.2.1 Western印迹杂交 提取组织蛋白, 采用考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白质含量. 取等蛋白量的样品, 电泳分离, 转印, 加入抗体室温杂交2 h, 用ECL试剂盒显色, X线片曝光, 并通过相应蛋白带的相对灰度值表示蛋白含量的变化.

1.2.2 RT-PCR半定量测定 用TRIzol提取胃癌组织的RNA, 合成cDNA第一链. 应用primer Premier5软件设计引物, 取3 μL cDNA 用于PCR 扩增, 扩增条件为: 建立25 μL反应体系, 95 °C预变性90 s, 循环28次, 循环条件为: 94 °C变性30 s , 58 °C退火1 min, 72 °C延伸1 min. 循环结束后72 °C延伸10 min. 取10 μL PCR产物进行电泳, EB染色, 扫描分析. mdm2基因拷贝数 ＝ mdm2电泳带相对灰度值/ β-actin电泳带相对灰度值.

统计学处理 采用x²检验判断统计结果. P<0.05具有统计学意义.

2 结果

2.1 Western免疫印迹杂交结果

经检测在胃癌中表达的MDM2高于对照组, 二者比较有显著性差异(P<0.05). 基因蛋白的表达与癌组织分化程度有一定关系图1. 高、中分化癌MDM2阳性率较高, 在低分化癌中阳性率较低, 但组间无显著性差异(P>0.05). 表达阳性率见表1.

表1 正常组织和胃癌组织中MDM2蛋白表达的阳性率.

	正常	低分化胃癌	中分化胃癌	高分化胃癌
阳性	0	2	3	5
阴性	6	6	5	3
阳性率(%)	0	25	37.5	62.5

P <0.05 vs 正常组织.

图1 Western免疫印迹杂交检测: 正常和胃癌组织中MDM2表达量的变化. 1: 正常胃组织; 2: 低分化胃癌; 3、4: 中分化胃癌; 5: 高分化胃癌.

2.2 RT-PCR半定量测定结果

在胃癌组织中mdm2基因扩增量明显高于对照组, 二者比较有显著性差异(P<0.05). 基因的扩增与癌组织分化程度相关(图2). 高、中分化癌呈现出较高的扩增率, 在低分化癌中扩增率较低, 组间有显著性差异(P<0.05). 扩增阳性率见表2.

表2 正常组织和胃癌组织中mdm2 mRNA扩增的阳性率.

	正常	低分化胃癌	中分化胃癌	高分化胃癌
阳性	0	1	3	7
阴性	6	7	5	1
阳性率(%)	0	12.5	37.5	87.5

P<0.05 vs 正常组织.

图2 RT－PCR检测: 正常和胃癌组织中mdm2 mRNA扩增量的变化. 1: 正常胃组织; 2: 低分化胃癌; 3、4: 中分化胃癌; 5: 高分化胃癌.

3 讨论

mdm2是近年来发现的癌基因, 位于染色体12q13-14, mdm2体内最重要的作用是抑制野生型p53的激活转录功能和抗肿瘤活性. 研究发现MDM2蛋白的过度表达导致同时表达的P53蛋白量减少, 突变引起的MDM2作用障碍导致P53的集聚和活化[1]. mdm2可因野生型p53诱导而转录增强, 其表达产物MDM2蛋白又转而可与P53蛋白形成复合物, 封闭其转录活性, 此即所谓P53/MDM2负反馈调节环. 此外, P53蛋白只在核内发挥作用, 其向核外转运可能以MDM2蛋白依赖的方式进行[2], 通过这两种机制, MDM2蛋白将野生型P53蛋白控制较低的无活性水平. Meltzer [3]提出, MDM2蛋白过表达和p53基因突变相似, 均可使p53基因功能丧失. mdm2除抑制抑癌基因p53产生, 其本身也有致癌作用. mdm2在细胞转化过程中起癌基因作用的证据很多[4], 部分肿瘤既有mdm2的过度表达又有p53的突变, 此类患者的预后比仅有两种变化之一的患者差很多, 另外在哺乳期mdm2转基因小鼠的乳房上皮中有其过度表达, 使得细胞癌变也是证据.

有关胃癌相关基因扩增及表达的研究较多[5-13], 而在胃癌中mdm2的表达鲜有报道. 本实验经Westernblot方法检测, MDM2蛋白表达的阳性率在胃癌中较高, 与正常组织相比有统计学意义, 提示MDM2蛋白表达异常在胃癌中的作用也是不容忽视的, 同时也进一步说明MDM2-P53功能异常是肿瘤发生中较为常见的分子机制. 本实验经RT-PCR方法检测表明, mdm2基因的扩增与胃癌组织的分化程度有相关性, 这一现象提示mdm2的基因扩增可能与胃癌的恶性程度及预后有关. 另外, 本实验结果可提示: 通过阻断P53-MDM2二者的相互作用或者降低MDM2含量, 或者将MDM2滞留于核内将会激活P53的肿瘤抑制功能, 同样可以增强P53的功能. 这种假设已在人类肿瘤得到证实, 即恶性胶质瘤、人类颈部肿瘤[14,15], 国内亦有学者在肺癌细胞中得到证实[16], 但胃癌方面的治疗作用还是空白, 有待进一步探索研究.

备注

$[Footnotes]

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