原发性肝癌乙酰肝素酶mRNA的表达及其意义

摘要

目的

探讨乙酰肝素酶(HPA)mRNA在肝细胞性肝癌(HCC)中的表达及其意义.

方法

收集33例HCC标本, 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测HCC癌及癌旁肝组织中HPA mRNA的表达, 并与HCC临床病理学指标进行统计学分析.

结果

33例HCC中有16例癌组织HPA mRNA表达阳性, 阳性率为48.5%, 显著高于癌周肝组织和对照肝组织(P<0.01). HCC癌组织HPA mRNA表达与肿瘤大小、包膜形成、AFP水平、HBsAg状态及肝硬化无关, 而与肿瘤转移复发有关.高转移复发倾向组癌组织HPA表达阳性率(71.4%, 10/14) 显著高于低转移复发倾向组(31.6%, 6/19)(P<0.05). 术后随访转移复发者HPA表达阳性率(78.6%, 11/14)显著高于无转移复发者(21.4%, 3/14)(P<0.01). 此外, HPA mRNA表达多见于分化较差(P<0.05)、TNM分期较晚(P<0.05)的患者.

结论

HCC有较高的HPA mRNA表达率, HPA阳性者术后转移复发的可能性较大, 可作为HCC转移活性的可靠标志之一.

关键词: N/A

N/A

N/A

Corresponding author: N/A

Received: October 29, 2002
Revised: November 10, 2002
Accepted: November 14, 2002
Published online: November 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

近20 a来, 原发性肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)手术切除率虽有所提高, 但总的治疗效果仍不够理想, 其主要原因为术后转移复发 [1,2], 且缺乏有效的监测指标和防治措施. 另一方面, 在过去十几年中, 有关肿瘤包括HCC转移的研究大多集中在底物为结构蛋白(包括胶原蛋白、层粘蛋白与玻璃体结合素等)的一些蛋白酶上(如基质金属蛋白酶、胶原蛋白酶和丝氨酸蛋白酶等)[3,4], 而对以肿瘤转移屏障(细胞外基质和基底膜)的另一种重要成分即硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)[5]为底物的乙酰肝素酶(heparanase, HPA)的研究则相对较少[4]. 我们应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测33例HCC标本中HPA的mRNA基因表达, 并结合患者的临床病理和随访资料, 以探讨HPA mRNA表达的意义.

1 材料和方法

1.1 材料

33例新鲜冷冻的HCC标本, 包括癌和癌旁肝组织, 为2000-08/2001-04浙江大学医学院附属第二医院外科手术切除并经病理证实. 另取9例肝脏良性肿瘤瘤周肝组织作正常对照. HCC组中, 男28例, 女5例; 年龄29-73岁, 平均49.2岁. 其中肿瘤最大径小于或等于5 cm者8例, 大于5 cm者25例; 肿瘤包膜完整14例, 不完整19例; AFP阳性21例, 阴性12例; HBsAg阳性24例, 阴性9例; 合并明显肝硬化18例, 无肝硬化15例; 肿瘤EdmondsonⅠ、Ⅱ级13例, Ⅲ、Ⅳ级20例; TNMⅠ、Ⅱ期18例, Ⅲ、Ⅳ期15例. 根据手术记录、术后病理报告等, 将有癌栓和(或)肝内播散即卫星癌灶和(或)淋巴结转移的14例HCC患者定为高转移复发倾向组. 反之, 无癌栓、肝内卫星癌灶和(或)淋巴结转移的19例HCC患者为低转移复发倾向组.全组有28例术后6-16 mo内获得随访, 占84.8%(28/33). 随访有、无转移复发者各14例. 肝脏良性肿瘤9例中, 男4例, 女5例; 年龄32-65岁, 平均41.2岁; 其中肝海绵状血管瘤8例, 肝局灶性结节性增生1例. Trizol总RNA分离试剂盒为Gibco公司产品, AMV和TagTM DNA 聚合酶均为TaKaRa产品. dNTP购自上海生工生物工程公司. 采用β-actin作为内参照, 其引物由上海博亚生物公司合成, 上游为5'-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3', 下游为5'-ATTGCTCCTCCTGAGCGCAA-3', 扩增片段长度为224 bp. HPA引物参照文献[6]设计, 由上海生物工程公司合成, 上游为5'-TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC-3', 下游为5'-GATTCAGTTACATGGCATCACTAC-3', 其扩增片段长度为585 bp. 所有引物均按要求将其浓度稀释为10 pmol/L.

1.2 方法

Trizol一步法提取组织总RNA, 甲醛变性胶电泳鉴定及紫外分光光度仪测定A值后, 逆转录合成cDNA. 取2 μL cDNA按50 μL反应体系行PCR扩增. HPA扩增条件为94 °C预变性4 min, 后转入94°C变性30 s、57 °C退火45 s、72 °C延伸1 min, 共35个周期, 然后再72 °C延伸5 min. 取10 μL产物于12 g/L的琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭紫外灯下观察拍照.

统计学处理 结果采用x²检验或四格表确切概率法分析, P<0.05为有统计学意义.

2 结果

2.1 HPA mRNA在肝癌组织中的表达

经RT-PCR扩增后电泳观察发现33例HCC癌组织中有16例于585 bp处可见阳性条带（图1）, 余17例阴性, HCC癌组织HPA mRNA表达阳性率为48.5%; 而癌周肝组织仅1例HPA表达呈阳性. 9例对照肝组织全部阴性. 经统计学处理二者P值均小于0.01, 差异有显著意义.

图1 肝素酶mRNA在HCC癌及癌周肝组织中的表达. 图示: Marker: DL2 000, 自上而下分别为2 000、1 000、750、500、250和100 bp的6个条带; T5 和T8 分别为第5和8号癌组织标本, 于585 bp处均有条带出现, HPA表达为阳性, 其中T8条带最亮; N5和N8为相应癌周肝组织标本, HPA表达均阴性.

2.2 HPA mRNA表达与肝癌临床病理特征的关系

结果发现, 肿瘤最大径小于或等于5 cm组和大于5 cm组分别有3例和13例、包膜完整组和不完整组分别有5例和11例、AFP及HBsAg阳性和阴性组均分别有12例和4例、伴或不伴肝硬化组各有8例HPA mRNA表达阳性. HPA mRNA表达在对应各组间差异无显著意义(P>0.05).EdmondsonⅠ、Ⅱ级组和Ⅲ、Ⅳ级组分别有3例和13例HPA mRNA表达阳性, 差异有显著意义(P<0.05); TNMⅠ、Ⅱ期组有6例, Ⅲ、Ⅳ期组10例阳性, 差异亦有显著意义(P<0.05).

2.3 HPA mRNA表达与转移复发的关系

高转移复发倾向组14例中有10例(71.4%)HPA mRNA表达阳性, 低转移复发倾向组19例中仅6例(31.6%)阳性, 二者有显著性差异(P<0.05). 经28例随访, 14例有明确转移复发的患者中11例(78.6%)HPA mRNA阳性, 另外14例未发现转移复发的患者中仅有3例(21.4%)HPA表达, 差异亦有显著意义(P<0.01)表1.

表1 HPA mRNA表达与肝细胞癌转移复发的关系.

项目	n	HPA阳性(n)	HPA阴性(n)	P值
转移复发倾向
高	14	10	4	0.023
低	19	6	13
随访结果
有转移复发	14	11	3	0.003
无转移复发	14	3	11

3 讨论

1999年前后, 哺乳类动物包括人HPA[6-12]基因已得以成功克隆和鉴定, 现认为该基因编码3.7 kb的人 cDNA, 跨度达50 kb以上, 含有14个外显子和13个内含子, 位于染色体4q22[13]. 在正常状态下, HPA主要分布在胎盘、血小板及部分免疫细胞内, 在胚胎形成、创伤愈合和炎症过程中发挥重要的生理作用.

在肿瘤状态下, 很多癌及其基质细胞亦可获得产生或分泌HPA的能力. 转移的恶性肿瘤细胞普遍表达HPA, 恶性黑色素瘤、结肠癌和肝癌等具高转移潜能的肿瘤细胞表达水平较高, 而低或无转移潜力的肿瘤细胞无或仅有少量表达[6,7]. 最近, 日本学者El-Assal et al [14]报告了他们关于HPA在HCC中的表达研究, 发现有47%的HCC癌组织HPA mRNA表达阳性. 我们用RT-PCR方法检测33例HCC标本HPA mRNA的表达情况, 结果发现有16例癌组织中HPA mRNA表达阳性, 占总数的48.5%, 与El-Assal et al研究的结果相似. 此外, 我们还同步检测了癌周和对照肝组织中HPA mRNA的表达情况, 结果表明近半数HCC癌组织具有合成或分泌HPA的功能, 而癌周和对照肝组织则不产生HPA.

HPA的主要病理作用是促进肿瘤细胞转移和血管生成. HPA通过水解断裂糖苷键而降解HSPG[15], 与其他蛋白水解酶协同破坏、降解细胞外基质和基底膜屏障, 促进肿瘤细胞侵袭和转移[6,15]; HPA还可激活纤溶酶原, 活化金属基质蛋白酶(MMPs), 促进碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的释放[16], 以发挥其促细胞转移和血管生成作用. 研究证明癌组织产生的HPA与肿瘤侵袭转移、血管生成等因素密切相关[4,6,7,17-22]. HPA表达活性升高的肿瘤转移复发的可能性及肿瘤微血管密度均增加. El-Assal et al [14]将HPA mRNA表达与HCC患者临床和病理指标进行分析, 发现HPA表达与肿瘤的大小、分期、分级、丙型肝炎病毒(HCV)感染、微血管形成、术后转移及预后有关, 而与其他临床病理因素无关.

本研究发现HPA表达与肝癌的病理分级、TNM分期和转移复发有关, 均与El-Assal et al [14]的结论相似.HPA阳性多见于肿瘤分化程度较低、病理分期较晚的患者. 高转移复发倾向组癌组织HPA表达阳性率(71.4%, 10/14)显著高于低转移复发倾向组(31.6%, 6/19), 初步表明HPA与肝癌侵袭转移的关系. 术后随访转移复发者HPA表达阳性率(78.6%, 11/14)显著高于无转移复发者(21.4%, 3/14), 进一步提示HPA表达阳性患者有较高的肿瘤侵袭性和术后复发倾向, 检测HPA可为临床预测HCC术后转移复发提供有价值的指标.

与El-Assal et al [14]的研究不同的是, 本研究未发现HPA表达与肿瘤大小和包膜完整度有关, 可能是由于本组5 cm以下病例较少(仅8例)的缘故. 此外, 本研究亦未发现HPA表达与病毒感染(HBsAg 状态)、AFP和肝硬化等因素有关, 可能是由于感染的病毒类型不同, El-Assal研究的HCC患者以丙型肝炎病毒(HCV)感染为主, 而我国HCC的发生大多与乙型肝炎病毒(HBV)感染、肝硬化有关, 少有HCV感染.

备注

$[Footnotes]

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