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世界华人消化杂志. 2003-11-15; 11(11): 1777-1781
在线出版日期: 2003-11-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i11.1777
食管癌中的等位基因缺失
李洁, 刘芝华
李洁, 刘芝华, 中国医学科学院, 中国协和医科大学, 肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室 北京市 100021
基金项目: 国家"973"重点基础研究发展规划项目资助, No. G1998051021.
通讯作者: 刘芝华, 100021, 北京市朝阳区潘家园南里17号, 中国医学科学院, 中国协和医科大学, 肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室. liuzh@pubem.cicams.ac.cn
电话: 010-67723789 传真: 010-67715058
收稿日期: 2003-04-03
修回日期: 2003-04-20
接受日期: 2003-05-21
在线出版日期: 2003-11-15

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一, 近年来对食管癌分子遗传基础研究取得了相当大的进展, 但其发生发展的分子机制仍不十分清楚. 在肿瘤研究中, 杂合性缺失是一种常用的等位基因缺失检测方法, 广泛用于候选抑癌基因的筛选及已知抑癌基因失活机制的阐明等方面. 并且等位基因异常在多种肿瘤中被证明是肿瘤发生早期事件, 因此杂合性缺失可能成为肿瘤筛查和早期诊断的重要工具. 等位基因缺失研究常用技术包括限制性片段长度多态性和微卫星分析等. 食管癌中常见的染色体缺失区及其相关基因有17号染色体短臂(p53基因)、13号染色体长臂(Rb基因)等. 本文对以上几方面以及等位基因缺失在食管癌发展不同时期的变化等作了较为详细的阐述.

关键词: N/A
引文著录: 李洁, 刘芝华. 食管癌中的等位基因缺失. 世界华人消化杂志 2003; 11(11): 1777-1781
N/A
N/A
Corresponding author: N/A
Received: April 3, 2003
Revised: April 20, 2003
Accepted: May 21, 2003
Published online: November 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

食管癌(esophageal cancer, EC)是世界上最常见的10种恶性肿瘤之一, 每年新增患者超过300000人, 并且大多发生于发展中国家[1]. 食管癌有两种主要形式, 鳞癌(squamous cell carcinoma, SCC)和腺癌(adenocarcinoma, ADC). 他们有不同的病因学和病理学特征.西方国家腺癌多见, 在美国腺癌占食管癌总数的50%左右. 我国食管癌占恶性肿瘤发病的第四位, 并且以鳞癌为主. 近10 a来, 对食管癌分子遗传基础研究取得了相当大的进展, 对食管癌病因学、病理学的研究和临床诊治产生了巨大的影响.

杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)是一种等位基因缺失, 表现为与同一个体正常组织相比, 肿瘤组织的一个等位基因消失.在扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphism) 分析中, 表现为肿瘤组织的一个等位基因与非肿瘤组织相应等位基因相同, 而另一等位基因消失或条带密度减少50%以上. 肿瘤细胞中的LOH已被证明是肿瘤特异性遗传缺失的有效指示剂, 这些缺失区域常包括与肿瘤发生有关的基因, 特别是候选抑癌基因. 在对Rb基因和p53基因的抑癌作用的阐明中, LOH就是一个关键的因素. 此外, 等位基因缺失也可作为遗传易感性或肿瘤早期检测的标志.

1 等位基因缺失研究常用技术

较早时期的杂合性缺失研究常采用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)技术, 通过观察基因组DNA经限制性内切酶水解后肿瘤组织与正常组织相比等位基因的改变来分析等位基因缺失的情况. 采集配对标本后, 分别提取基因组DNA, 特定的限制性内切酶酶切、电泳、转印, 与标记探针进行Southern杂交, 分析等位基因的变化. PCR方法问世后, RFLP分析不再停留于传统的Southern杂交, 进一步采用更快速、简便、灵敏度高, 以及DNA样本用量低的PCR结合RFLP法, 即PCR-RFLP, 首先设计PCR引物, 使其扩增片段包含多态性限制性酶切位点序列, PCR扩增后, 用相应的内切酶酶切PCR产物, 直接电泳以观察酶切片段的长度多态性变化.

近年来, 随着微卫星(microsatellite)的发现和研究的深入, 微卫星分析逐渐取代RFLP成为检测等位基因缺失的主要方法. 他比RFLP方法简易快速, 其基本方法为首先用PCR技术扩增选定的微卫星核苷酸重复序列, 然后用凝胶电泳分析DNA序列的变化.电泳后可以直接用银染法染色观察结果, 或者根据引物标记物的不同(同位素标记或荧光素标记), 分别采用放射自显影或者荧光自动化分析系统观察分析结果.

2 各个染色体缺失区及其相关基因

食管癌中等位基因缺失的研究发现, 2q, 3p, 3q, 4p, 4q, 5q, 6q, 8p, 9p, 9q, 10p, 11p, 13q, 14q, 15q, 17p, 17q, 18q, 19q, 21q有较高的LOH频率(30%以上), 其中2q, 4p, 4q, 6q, 14q, 15q是最近发现的新的较高频率缺失区域[2-4](表1). 在SCC和ADC中, 各个位点的缺失频率基本上没有显著差别.

表1 常见等位基因缺失区及相关基因.
染色体共同缺失区候选基因突变肿瘤异常
1p1p36p73少LOH; ?
3p3p21.3-p22hMLH-1
DLC1转录抑制
3p13-p14FHITLOH; 甲基化
5q5q21.2APC/MCC极少甲基化; LOH
8p8p22FEZ1转录抑制
9p9p22p15(MTS-1), p16纯合缺失,
启动子区甲基化
9q9q22PTCH有突变; LOH
9q31ESS1
13q13q14Rb无LOH; 表达缺失
13q33-34ING1有缺失; 突变
16q16q23.3-q24.1WWOX
17p17p13p53高点突变; LOH
17q17q25TOCLOH; ？
17q21.3BCRA1
18q18q21.1Smad
18q23.3DCC少
2.1 17号染色体短臂(17p)

如同在多种人类肿瘤中一样, 17p等位基因缺失在食管癌中经常发生, 其缺失通常围绕p53基因所在的17p13.p53转录产物分子量为53 kD, 是具有序列特异的DNA结合特性的磷酸蛋白.正常细胞持续合成P53蛋白但并不在细胞中积聚. 当细胞暴露在DNA损伤因素中, P53蛋白稳定性增加并激活使细胞停止在G1期及诱导细胞凋亡的靶基因, 使含有受损DNA的细胞或停留在G1期修复或发生凋亡, 从而防止损伤DNA的复制.

Wagata et al [5]报道在日本45%的食管鳞癌中存在17p上p53所在位置缺失, 并分析了p53突变与17p缺失之间的关系. 其研究结果显示, 16例17p缺失中12例有突变, 而11例无17p缺失的有2例有突变, 提示p53基因突变与17p缺失可能密切相关. 免疫组化结果显示突变与p53异常表达之间有很好的关联.Hu et al [6] 对56例来自中国食管癌高发区的ESCC标本的研究结果与前者一致, p53的多种遗传改变提示这些肿瘤具有高度遗传不稳定性的特点, p53是失活的主要靶基因, 可能在ESCC的发生、发展过程中起重要作用. 另外, 有研究数据显示, 在食管癌中, 17p两条等位基因都存在的情况下, p53的一条等位基因也常发生突变, 这一发现提示p53突变是食管癌发生中的早期变化; 并且突变的P53蛋白可能发挥占支配地位的反作用, 抵消了保留下来的野生型等位基因的作用. 突变的存在可能有利于较晚时期另一条等位基因缺失发生. 然而, 应该指出的是, 在许多病例中, 即使保留下来的p53等位基因没有突变, 17p等位基因也会有缺失, 这种情况指出在这个染色体区可能还存在其他的抑癌基因.

除17p13.2-p13.1(p53)之外, 有研究者[7]对整个17p作LOH发现另2个高频缺失区(大于或等于80%), 包括17p13.3-p13.2(VCA1, OVCA2, HIC-1), 17p13.1-p12(ZNF18, ZNF29, ALDH3, ALDH10).

2.2 17号染色体长臂(17q)

Mori et al [8]检测了94例ESCC中17q的LOH, 62% (56/91)有至少一个多态标记发生LOH. 共同缺失区定位于17q21.3, 这一区域包括BRCA1基因. 分析实验结果与临床病理资料发现, 17q的缺失通常发生在肿瘤发生早期阶段. 在女性患者中17q LOH发生率显著高于男性.

胼胝症(tylosis)是一种罕见的常染色体显性综合征, 与ESCC的高发有关. 在散发的ESCC中, TOC (tylosis esophageal cancer)基因所在的17q25 LOH发生频率非常高(64-80%)[9], 说明17q25可能存在与ESCC有关的抑癌基因, 支持了TOC基因参与部分散发ESCC形成过程的假设, 但仍需要进一步的研究加以证实.

2.3 13号染色体长臂(13q)

有研究发现13q的LOH与ESCC的淋巴结转移和预后差有关. Rb基因位于13q14, 是最早确定的抑癌基因. Rb蛋白通过磷酸化和去磷酸化调节细胞周期, Rb基因失活可使细胞G1期调控点异常, 细胞过度增生. ESCC中Rb基因所在区LOH高达55%, 在Rb LOH的肿瘤标本中, 90%显示Rb表达水平降低或检测不到, 而没有LOH的标本中, 只有20% Rb表达改变. 基因的突变未见普遍发生. 在Rb基因的LOH和Rb蛋白的表达异常之间有很强相关性, 提示LOH可能是导致Rb失活的主要事件. 但Rb-LOH与淋巴结转移缺乏显著相关, Rb基因失活可能与淋巴结转移无关. 在伴随p53基因突变的肿瘤中, Rb LOH发生率显著提高, 二者之间具有较强相关性; 提示Rb和p53通路的缺陷及他们在细胞周期和细胞凋亡调控中潜在的协同作用可能是食管癌发生的重要机制[10,11]. 进一步研究发现13q12-13缺失频率(38.6-43.7%)较高, 但这一区域的BRCA2基因未检测出肿瘤特异性突变, 也未发现表达缺失, 提示BRCA2可能不是等位缺失的靶基因. 此区的候选抑癌基因AS3是否与ESCC发生和淋巴结转移有关仍不清楚. 此区域可能存在与原发ESCC发展及淋巴结转移有关的还未证实的抑癌基因, 其位置很可能位于13q12.3-q13.1和13q12.11[12-14]. 另外, 在有上消化道家族史和无家族史的患者中对照研究表明13q LOH有家族史的明显高于无家族史的, 提示13q可能存在与食管癌遗传易感性有关的基因[3].

13q33-34的候选抑癌基因ING1在ESCC中有58.9%的缺失率, 并检测到4个肿瘤特异性错义突变. ING1可能在ESCC的发展中有作用. 免疫组化显示所有标本(31)均无ING1蛋白表达, 可能遗传改变和外遗传改变一同使ING1失去了正常功能[15]. 新近发现的13q14.1-q14.3缺失区也是一个值得关注的区段, 包括候选基因ESD, HTR2, LCP1[16].

2.4 9号染色体

自从发现9p在ADC和SSC中都有很高的LOH, 位于9p21的p16(CDKN2/MTS1)和p15(CDKN2B/MTS2)基因失活与食管癌的关系引起了研究者极大的兴趣. p16和p15属于INK4I(cyclin-dependent kinase 4 inhibitors)家族, 在细胞周期G1期调控细胞增生. 他们的失活可能与肿瘤细胞恶性增生有关. 在ESCC细胞系中, 55%细胞系显示p16, p15和/或9p21相邻位点有纯合性缺失. 缺乏纯合缺失的细胞系未检测到突变. RT-PCR证明mRNA水平的改变与其纯合缺失之间有非常好的相关性. 因此, p16和p15的失活可能与食管细胞恶性表型有关, 而纯合缺失是其失活的主要机制.或者, 在其紧邻区可能存在缺失的靶基因. 在ESCC肿瘤标本的研究中发现, p16失活占优势作用的是启动子区CpG岛异常甲基化, 突变和纯合缺失相对很低. 突变可能出现在不典型增生和ESCC发生之前, 纯合缺失可能是p16沉默之后的事件. 而p15常发生纯合缺失. 提示这两个基因通过不同的机制失活[17,18]. p16失活和p53 LOH之间有相反的关系, 提示p16和p53参与了两条重要且独立的与ESCC靶基因失活有关的细胞通路[19].

9q末端区域LOH在包括ESCC的多种肿瘤中时常发生, 提示9q末端可能存在与多种组织鳞状细胞癌相关的抑癌基因.位于9q22的PTCH (the human homologue of the Drosophla segment polarity gene patched )被认为是痣样基底细胞癌综合征和散发的基底细胞癌的抑癌基因. Maesawa et al [20]研究结果提示在部分ESCC中, PTCH基因可能通过突变和LOH双重打击机制而失活. 位于9q22-31的ESS1是另一个候选基因.

2.5 3, 5, 18号染色体

3号染色体上的等位基因缺失见于3q25, 3p22, 3p13-14.3q25 LOH与淋巴结转移显著相关.位于3p22附近的hMLH是一个错配修复基因, 与HNPCC (hereditary non-polyposis colorectal cancer)的易感性相关. 有报道在散发性结直肠癌、子宫内膜癌和胃癌中hMLH启动子区高甲基化可引起微卫星不稳定性[21]. FHIT定位于3p14, 跨越了FRA3B脆性位点.FHIT基因失活可能与基因缺失和5'CpG岛甲基化有关, 其蛋白表达下降与ESCC的发展有关, 但是与预后和吸烟史的关系可能不大. FHIT在食管癌的发展中可能有重要作用[22,23].

APC和MCC紧密连锁, 定位于5q21, LOH可达50%以上, 但二者缺失无相关性. Shibagaki et al [24]检测了60例原发ESCC和20个ESCC细胞系APC基因第15外显子(突变热点)的突变情况, 未发现任何突变.Aoki et al [25]检测了APC三分之一的编码区, 也未发现突变. Kawakami et al [26]发现APC启动子区甲基化在ADC和SCC中都很高, 分别为92% (48/52)和50%(16/32). 甲基化可能是APC失活的主要机制. 或者, 5q还可能存在别的与食管癌有关的基因. 5p15.2也有较高LOH, 而且SCC中5p15.2缺失显著高于ADC, 5p上可能存在未知的抑癌基因.

18号染色体LOH高频区包括18q12.2-q12.1, 18p11.2和18q21.1, 包括已知脆性位点FRA18A[27,28]. DCC基因位于18q23.3, 但是18q LOH共同缺失区不包括DCC所在位置. DCC-LOH与淋巴结转移、病理分级与肿瘤分期均无显著相关性, 提示18q可能存在其他与ESCC发生、发展有关的未知抑癌基因. 而另一研究小组报告对51例原发性ESCC中DCC的点突变和缺失情况进行检测, 发现在中低分化而不是高分化鳞癌中存在等位缺失, 说明DCC基因异常与分化程度有关. DCC基因与ESCC发生、发展的关系有待进一步研究. MAD (mothers against decapentaplegic)相关基因Smad2和Smad4已被定位于18q21.1. Maesawa et al [29]检测了30例原发ESCC和7个ESCC细胞系Smad2和Smad4的基因内突变和LOH发生频率. LOH 35%, 但未检测到突变和细胞系内的纯合缺失, 提示MAD相关基因异常在ESCC中不常见.Osawa et al [30]的报道与之一致. Smad家族在食管癌中的作用还有待研究.

2.6 其他染色体

在成神经细胞瘤和其他多种肿瘤中多个抑癌基因位于1p36.p73基因定位于1p36.3, 编码p53同源蛋白. 在食管癌中, p73等位基因多态性普遍存在, 基因突变少见. 和p53不同, p73等位基因缺失或突变可能并不是肿瘤发生的主要遗传事件. 肿瘤组织中p73的过表达与p53缺陷显著相关, 可能是p53缺陷的部分代偿机制. p73 AT/AT纯合子在肿瘤人群中显著少于正常对照人群, 且在AT/GC的杂合子中LOH为37.8%(14/51), 所有缺失均丢失AT等位基因. 提示p73 AT/AT纯合可能有防止食管癌发展的作用[31,32].

WWOX(WW domain containing oxidoreductase)是定位于16q23.3-24.1的候选抑癌基因, 这一区域包括FRA16D脆性位点.在ESCC中, WWOX-LOH 39% (14/36), 并检测出肿瘤特异性错义突变和基因转录畸变.提示WWOX失活在ESCC中可能有重要作用[33].

食管癌中6号染色体上抑癌基因p21(Waf 1)所在位置有高比率的LOH, 其邻近的HLA class I mRNA和蛋白水平普遍下调, 但LOH和微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)相对较低, HLA-A, -B, -C启动子区高甲基化是其转录失活的主要机制[34].

11号染色体中11p15.5和11q22.3[35], 21号染色体整个长臂都经常发生缺失, 后者多发生在TNM分期的早期[36]. 这些区段可能存在未知的抑癌基因.

3 等位基因缺失在食管癌发展不同时期的变化

食管癌是一系列组织病理改变的结果, 典型的病理改变包括食管炎, 萎缩, 轻度到重度的不典型增生, 原位癌, 直至最终形成浸润癌[37]. 迄今为止, 对等位基因缺失在食管癌发展不同时期的变化的研究报道仍比较少. Roth et al [38]等选用了12个多态性标记比较低度不典型增生、 重度不典型增生、浸润癌三个时期的LOH, 结果显示在早期3p, 4p, 9q, 13q发生LOH, 随着病变严重程度的增加, LOH频率增高, 并且8p, 9p, 11p, 17p上另外8个多态性位点也检测到了LOH, 提示这些位点在增生较晚时期发生等位基因缺失.

另外有研究者[39,40]报道在5q等位基因缺失之前, 13q, 17q, 18q可出现联合缺失.

4 问题与展望

等位基因缺失分析已成为研究已知抑癌基因和寻找新的抑癌基因的重要线索. 利用这种方法, 大量新的候选抑癌基因被定位于不同的染色体区域, 并已有一些基因被定位克隆和鉴定. 另外, 在多种肿瘤中等位基因异常被证明是肿瘤发生早期事件, 这使LOH作为肿瘤筛查和早期诊断的重要工具成为可能. 未来的研究方向可主要归纳为以下几个方面: (1)通过等位基因缺失筛选出的多个候选抑癌基因有待于进一步研究证实其在食管癌发生、发展中的作用; (2)应用一次可以检测上千个单核苷酸多态(SNPs)的DNA芯片在整个基因组中寻找高频LOH区也是一个值得关注的研究方向; (3)通过LOH可比较食管癌家族史与非家族史、肿瘤发展各阶段、不同分化程度肿瘤、各致病因素以及继发性肿瘤与原发性肿瘤之间的关系; (4)希望通过LOH找到合适位点作为肿瘤早期诊断的分子标志物, 为高发区普查和临床诊断提供方便可靠的辅助诊断方法.

目前, LOH多选用微卫星作为多态性标记. 微卫星作为一种出色的遗传标记, 他具有信息量大、多态性高、稳定性好、检测方便等优势. 微卫星杂合性缺失在肿瘤研究中的应用已经在肿瘤工作者面前展现出一片诱人的前景, 不过仍有许多问题需要解决: (1)由于微卫星数目大, 分布广, 如何选取适当的位点实在令人困惑; (2)许多研究者相互矛盾的结论, 也需要在更加一致的研究标准下扩大研究范围来取得共识; (3)在研究方法上, 传统的同位素标记和银染技术, 也有待被快速、灵敏、无害的自动荧光检测技术所取代.

但人们有理由相信, 随着分子生物学技术的进展以及微卫星基础研究的深入, 杂合性缺失技术必将在肿瘤研究领域发挥更大的作用.

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