修回日期: 2003-04-30
接受日期: 2003-05-21
在线出版日期: 2003-11-15
食管鳞状细胞癌是一种分化缺陷性疾病, 细胞分化在食管鳞癌的发生、发展及治疗中的作用成为肿瘤领域的研究热点. 细胞分化异常导致上皮细胞发生恶性转化, 是食管鳞癌发生的重要机制之一. 目前对于食管鳞癌分化的主要判定方法有形态学指标、细胞周期动力学测定及基因型变化的测定等, 细胞分化方面能否取得巨大进展在一定程度上取决于分化标准的认识. 随着细胞分子肿瘤学的发展, 近来研究方向主要集中在食管鳞癌分化相关基因的筛选验证、基因表达调控机制的探讨以及分化诱导的体外研究等方面.本文从细胞分化角度, 对食管鳞癌的研究现状、最新进展和前景展望等作综合阐述.
引文著录: 孔建平, 刘芝华, 吴旻. 细胞分化与食管鳞状细胞癌. 世界华人消化杂志 2003; 11(11): 1665-1669
Revised: April 30, 2003
Accepted: May 21, 2003
Published online: November 15, 2003
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(11): 1665-1669
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i11/1665.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i11.1665
食管癌是人类常见恶性肿瘤之一, 其发病率具有明显的区域性, 其中70%在我国, 死亡率位居第4位, 5 a生存率低于10%. 食管癌按病理类型主要分为鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)和腺癌(adenocarcinoma, ADC), 二者在病因学与病理学特征上存在明显差异, 在中国食管鳞癌发生率明显高于腺癌[1]. 近年, 随着细胞学、分子生物学、肿瘤学等的发展, 细胞分化在肿瘤的发生、发展及治疗中的作用成为肿瘤领域的研究热点. 本文对细胞分化及其与食管鳞癌关系的研究综述如下.
细胞分化是指同源细胞逐渐发育为具备稳定形态结构、生理功能和生化特征的另一类型细胞的过程. 作为多细胞生物的最基本的生命活动之一, 细胞分化与细胞增生和细胞凋亡等生命活动密切相关, 细胞分化异常在肿瘤发病过程中发挥重要作用. 肿瘤的发生是一个多因素、多阶段、多步骤的渐进过程, 经历了不同阶段的表型和遗传型改变, 逐渐形成具有恶性相关表型的细胞群, 最基本特征是过度增生, 常伴有分化特性的进行性减低或完全丧失[2]. 不管癌细胞是来自成熟细胞的反分化, 或来自未成熟细胞的异常分化, 还是阻抑正常细胞的分化, 都可以看作是一种细胞分化的疾病, 其中食管鳞癌就是较为典型的一种.
食管黏膜不同于胃肠道等其他部位黏膜上皮, 为未角化复层扁平鳞状上皮, 其中基底层由具有增生能力的未成熟细胞组成, 该层以上由处于不同分化阶段的成熟细胞组成. 鳞状细胞分化是一个多步骤过程, 伴随多个鳞状细胞特异性基因先后表达. 正常食管黏膜依靠表层细胞的分化与基底细胞的分裂间相互平衡维持上皮组织稳定性.许多因素可以打破这一精细平衡, 导致上皮细胞发生恶性转化, 正常鳞状细胞分化的破坏可能是食管鳞癌发生的重要机制之一[3].
不同类型的细胞具有不同的生物学特点, 因此判定细胞是否分化的标准也不相同. 在血液病尤其是白血病细胞分化方面之所以能够取得巨大进步, 很大程度上取决于人们对血细胞分化标准的认识. 目前鳞状细胞分化的基本判定方法如下.
与鳞状上皮的基底细胞相比, 鳞状上皮细胞在分化过程中在细胞水平和亚细胞水平均经历一定变化. 从细胞水平来看, 细胞变扁平, 体积增大, 胞质密度减低, 核变大, 核密度亦减低, 细胞间隙加宽, 生长缓慢.在亚细胞水平上, 张力原纤维束增加; 桥粒增加; 细胞器增多; 多聚核糖体减少, 游离核糖体增多; 微绒毛减少; 核外形规整, 核/浆比减小[4,5].
利用流式细胞术分析细胞群体的细胞周期及DNA含量变化也是目前常用的判定方法之一. 分化细胞S期百分率下降, G0/G1期细胞百分率升高, 表明细胞周期停滞于G1检验点.
随着分子生物学的广泛应用和肿瘤学的系列突破, 在食管鳞癌细胞分化相关研究上取得了长足进步, 如: 分化相关基因的筛选验证、基因表达调控机制的探讨等.
随着研究工作的不断深入, 目前已发现在公认的各类基因中均有分化相关基因分布(表1), 参与食管鳞癌发生、发展. 通过以往对食管鳞癌病例中多个差异表达基因进行研究, 发现基因异常与疾病的病理分级有关, 肿瘤分化程度越差, 则基因改变累积越多[6].
| 基因类别 | 基因型 | 相关性 |
| 原癌基因 /抑癌基因 | MET, Fra-1, Neogenin, c-src, p63 | + |
| DCC | ? | |
| 细胞周期调控基因 | cyclinB1, Id-1 | + |
| cyclinD1 | - | |
| 凋亡相关基因 | bcl-X/Bcl-2 | ? |
| 细胞因子和黏附分子 | EGF, E-cadherin | + |
| BMP-6, Syndecan-1 | - | |
| EDC相关基因及 | Keratin (4, 13), annexinI, Involucrin, loricrin | + |
| S100家族 | TG3, SPRR (1B, 2A, 3), S100 (A2, A6, A12) | ? |
| EphA2, SKALP/elafin | + | |
| 酶类及其抑制剂 | tolemarase | ? |
| hnRNPB1, MRP | + | |
| 其他 | hsp70, hsp27 | - |
| p150, α-catenin, β-catenin, plakoglobin, | ? | |
| CEA, IAP, SQM1, TA-4, CD15 | ? |
3.1.1 原癌基因/抑癌基因 原癌基因/抑癌基因在细胞的增生、分化过程中起重要的调控作用. Hu et al [7]采用cDNA微阵列技术对食管鳞癌分析得到肿瘤相关基因差异表达谱, 经进一步验证, 先后发现原癌基因MET、Fra-1和Neogenin在食管鳞癌细胞系和相应原发肿瘤中均表达上调, 其过表达与食管鳞癌的分化程度相关. 而关于原癌基因c-src的研究表明, 在食管鳞癌的I、II、III不同分化级别中, pp60c-src的阳性率分别是80.0%、68.4%、33.3% (P<0.005). c-src基因的激活及过表达与食管鳞癌的起始和发生有关, 并且在肿瘤发展过程中表达量的增加与分化程度相关联[8]. p63是一个p53相关的DNA结合蛋白, 调节上皮原祖细胞的增生和分化.其在食管鳞状细胞不典型增生和鳞癌中呈弥漫性分布, 在食管鳞癌中p63表达上调提示其可能参与癌变[9]. 上述基因的表达产物均已明确与分化程度呈正相关.
DCC是一种与神经细胞黏附分子具有氨基酸序列同源性的抑癌基因. Miyake et al [10]检测了51例原发性食管鳞癌中DCC的点突变和LOH(杂合性缺失), 结果提示DCC基因异常与分化程度有关; 但Maesawa et al [11]则认为DCC-LOH与组织病理分级和肿瘤分期之间的相关性无统计学意义. 因此, DCC基因异常与分化是否有关尚存在争议.
3.1.2 细胞周期相关蛋白 上皮分化过程与细胞周期相关蛋白密切关联, CKIs与Cyclin/cdk复合物结合, 在多种细胞类型中抑制细胞周期运行和诱导分化. 食管鳞癌中细胞周期调控机制异常, 特别是主要元件表达异常, 可能影响细胞分化正常运行. Cyclin D1过表达常见于低分化鳞癌, 其表达与肿瘤分化程度呈负相关, 而与有丝分裂活性呈正相关, 也可能在食管癌发生中起到重要作用[12]. 正常食管黏膜上皮基底层仅少数细胞表达Cyclin B1, 即Cyclin B1阳性, 而随不典型增生程度的加重阳性细胞数逐渐增加, 癌中则高达20%以上. Cyclin B1过表达情况与病理分级参数相关, 可能参与食管鳞癌发生和预后[13]. Hu et al [7]从食管鳞癌差异表达基因谱中还发现细胞周期相关基因Id-1上调, 与肿瘤分化具有一定关系.
3.1.3 酶类及酶的抑制剂 EphA2是受体酪氨酸激酶Eph家族成员之一, 可以作为ephrins与细胞结合配体相互作用. Miyazaki et al [14]得出结论, EphA2 过表达与食管鳞癌的低分化以及淋巴结转移有关. Asai et al [15]对食管鳞癌中端粒酶活性(TA)以及端粒酶RNA表达情况作了较为全面的研究, 发现TA 的活化是受细胞分化而不是增生调控的[15]; 而后来Li et al [16]利用显微切割-TRAP方法证实在食管鳞癌组织中TA与肿瘤分化无关.因此有关TA是否与细胞分化相关还有待进一步证实. SKALP/elafin是一种新发现的可诱导的弹性蛋白酶抑制因子. Yamamoto et al [17]推测该酶的抑制因子可能参与食管鳞癌细胞分化和凋亡的诱导.其他酶类如: 丝氨酸蛋白酶、NOS和乙酰肝素酶表达改变与肿瘤的分化程度及患者生存期无关, 因而不能作为食管鳞癌的预后标记物, 但可能是食管癌变的一个早期事件.
3.1.4 凋亡相关基因 Bcl-2家族是细胞程序性凋亡的调控因子之一, 在人类各种肿瘤的发生、发展中起到重要作用. Koide et al [18]学者用Bcl-2蛋白单抗对42例食管鳞癌进行免疫组化检测, 发现正常食管上皮基底层细胞胞质着色, 某些高中分化鳞癌癌索外周部分也呈阳性, 而低分化鳞癌细胞着色弱或几乎不着色. 但统计分析表明Bcl-2(+)和Bcl-2 (-)食管鳞癌之间在病理性质和生存期方面并无明显差异.而Takayama et al [19]却发现, Bcl-2的表达与pT类别和组织分级(P = 0.001)有关; bcl-X表达则具有组织分级相关倾向(P = 0.081). Bcl-2和Bcl-X二者之间存在负相关(P = 0.001), Bcl-2家族成员, 特别是Bcl-X可能在食管鳞癌发生中具有重要地位. 由此可见, Bcl-2家族在食管鳞癌分化中的作用还有待深入研究.
3.1.5 细胞因子和黏附分子 细胞因子和黏附分子具有多种生物学功能, 近年来对他们与食管上皮分化的关系也作了较为广泛的研究. EGF和EGFR在上皮增生和分化中具有重要作用, 因此相关研究起步较早. 不同结果表明, 食管鳞癌中EGF表达量与分化程度明显相关(P<0.01); 而EGFR表达量虽低, 但具有高亲和力[20]. BMPs(bone morphogentic proteins)是一种多功能细胞因子, 其中BMP-6参与角质的早期形成. 食管鳞癌常表现为角化异常, 因此Raida et al [21]从mRNA和蛋白水平测定了BMP-6和EGFR在172例食管鳞癌中的表达情况, 结果表明BMP-6蛋白与肿瘤细胞的分化级别呈负相关, 对不良预后具有一定的提示作用, 而EGFR活化对于BMP-6表达的调控是非常关键的.
E-cadherin是一种细胞膜表面分子, 介导正常上皮细胞-细胞间的黏附. Wu et al [22]用免疫组化分析了73例食管癌手术切除组织, 发现E-cadherin在肿瘤邻近或远处正常鳞状上皮表达水平较高(93-100%), 并且在大部分(75-100%)高分化食管鳞癌中也表达, 而在低分化食管鳞癌中表达不足40%. 另一种膜表面黏附分子硫酸乙酰肝素黏蛋白(Syndecan-1), 其表达量与肿瘤细胞分化级别呈正相关, 而与乙酰肝素酶呈负相关. 即Syndecan-1缺失和乙酰肝素酶过表达与恶性潜能密切相关.
3.1.6 EDC相关基因及S100家族 正常未角化复层鳞状上皮表面成熟细胞内含有相互交联的蛋白包被, 即EDC(表皮分化复合物); 而食管鳞癌典型特征是分化程度减低, 形成交联复合物的能力下降, 呈终末分化通路缺陷. 表皮分化复合物的形成是一个酶促反应过程, 其中转谷氨酰酶(TG)起了重要作用. Chen et al [23]报道TG3在食管鳞癌中表达明显减少或缺失. 作为表皮分化复合物的组成成员, TG3的底物Involucrin, loricrin, annexinI, SPRR(1B, 2A, 3), Cystatin(A, B), keratin (4, 13), S100A6等已被我室以及其他学者先后发现和证实, 在食管鳞癌中普遍表达下调或缺失可能是食管癌细胞去分化和恶性增生的原因之一. 最近夏书华et al [24]从食管鳞癌的蛋白表达谱中也找到差异表达的annexin I, 并进一步验证了其表达与食管鳞癌的分化密切相关. 胞质钙离子浓度控制细胞凋亡、分化等一系列细胞反应, 胞内S100钙离子结合蛋白是转导钙离子信号的关键分子. 其中S100A2作为一个候选抑癌基因, Kyriazanos et al [25]认为其表达情况的评价对于食管鳞癌的治疗和预后具有重要意义; S100A12或CAAF1同属S100家族, Hitomi et al [26]证实S100A12与食管上皮细胞终末分化密切相关; 而家族另一成员S100P则涉及食管上皮细胞早期分化过程.
3.1.7 其他分化相关基因 Mucin基因的表达具有上皮组织特异性. Guillem et al [27]选用了分别针对基因MUC1-7的特异性探针进行原位杂交和Northern blot检测, 发现仅MUC4表达与鳞状细胞分化有关, 是一种可靠的食管细胞分化的表型标记物.
热、化学和机械刺激在食管鳞癌发生中起主要作用, 热休克蛋白(heat shock protein, hsp)是由各种生理应激或病理状态等环境因素的刺激下在细胞内诱发产生的. 国内对hsp25、hsp60、hsp70三种类型蛋白在食管癌中的表达状况进行研究, 发现仅hsp70在不同分化程度的食管癌阳性表达率有所不同.Lambot et al [28]首次发现hsp27仅见于正常食管上皮表层, 而在癌变区从不典型增生至浸润癌表达量明显增加, 未分化区达到最高, 疑与分化有关.
最近研究发现hnRNPB1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein B1)在人肺鳞癌和口腔鳞癌中过表达. Matsuyama et al [29]研究了hnRNPB1在食管鳞状细胞癌中的表达情况, 发现非癌变区则未见明显改变, 而63%癌变区表达增加, 特别是癌珠和中高分化食管鳞癌未角化的癌巢区细胞, 癌变区hnRNPB1表达增强与组织病理分级相关.经进一步验证, 推测hnRNPB1可作为一个独立的分子标记物用于食管鳞癌的诊断.
MRP (multidrug resistance protein)是一种膜磷酸化糖蛋白, 参与人类肿瘤细胞多药耐药.Nooter et al [30]发现在86例食管鳞癌中高分化癌MRP阳性比例明显高于中低分化癌. MRP的表达与胃肠道肿瘤细胞的分化相关, 可能参与高分化食管鳞癌内源耐药. 此外, p150, α-catenin, β-catenin, plakoglobin, CEA, IAP, SQM1, TA-4, CD15等多个基因也先后被证实与分化相关, 可作为食管癌分化标记物用于病理诊断和预后判断.
细胞分化是基因选择性表达的过程, 机体细胞进行正常分化需要一整套精细调控机制, 分化相关基因的转录表达调控以及细胞微环境都不同程度地参与了分化调控.
细胞分化过程中, 基因表达的调节主要发生在转录水平. 转录因子ets家族由多个成员组成, 依据细胞和组织的型别不同发挥多种生物学功能. 新命名的ELF3基因属于ets家族, Brembeck et al [31]通过研究其在转录调控中的作用, 发现ELF3既可以抑制参与食管鳞状上皮早期分化的keratin4启动子活性, 还可激活晚期分化相关的SPRR2A启动子, 结果提示ELF3在参与鳞状上皮分化的基因转录调控中具有双重作用, 在keratin 4启动子转录抑制中不排除通过DNA结合介导这一途径. PAX基因编码一组在胚胎发育中起重要作用的转录因子, 其表达上调参与了某些肿瘤的发生. Gerber et al [32]发现其中PAX9蛋白在成人正常食管黏膜上皮表达, 但在大多数浸润癌和具有癌前病变可能的不典型增生组织表达缺失或明显减少. 这一结果表明PAX9是食管角化细胞分化异常的敏感标记物, 在内复层鳞状上皮正常分化过程中具有重要作用. 与其他肿瘤不同, 大多数人食管鳞状细胞癌的发生不需要转录因子PAX9的表达上调. Kadowaki et al [4]报道, 在食管癌细胞中转染的外源性基因p21可以转录激活Involucrin基因的上游启动子功能, 因此p21可能参与细胞分化的调控.
细胞微环境中某些生长因子对分化也会产生一定影响. NGF与其受体TrkA结合可以激活胞内酪氨酸激酶, 调节各种非神经源性肿瘤的生长和分化. Zhu et al [33]研究发现NGF表达下调与低分化食管癌(P<0.01)和晚期癌分级(P<0.01)有关, TrkA低表达与晚期癌分级(P<0.05)相关. NGF/TrkA通路失活发生于肿瘤渐进过程中, 可能是一条导致食管癌分化缺陷的重要通路.
肿瘤细胞分化诱导疗法的基本特点为不杀伤肿瘤细胞, 而诱导肿瘤细胞分化为正常或接近正常细胞. 目前对癌细胞分化的称谓有所不同, 如: 逆转、表型逆转、逆向转化、正常化、脱癌、去恶性及去恶化等, 但均表现为肿瘤细胞向正常细胞方向发展. 分化诱导疗法的提出, 打破了1950年代曾流行的 一旦成了癌细胞, 便永远是癌细胞 的观点. 作为肿瘤治疗的一条重要途径, 癌细胞的分化诱导疗法已成为国际肿瘤研究的新热点.食管鳞癌分化诱导剂主要如下.
随着ATRA(全反式维甲酸)治疗急性早幼粒细胞性白血病的成功实践, 诱导分化治疗已逐渐扩展到其他白血病甚至实体瘤. 我室较早选用ATRA诱导食管癌细胞系EC8712, 除观察到细胞生长受到明显抑制和出现终末分化外, 还用消减杂交获得多个差异表达基因, 如RA538、RA 28等 [34]. Muller et al [35]观察了维甲酸和N-(4-hydroxy-phenyl) retinamide对食管鳞癌生物学特性的影响, 可见细胞表型改变、生长抑制和EGFR明显下调, 但细胞既不能阻滞于G1期, 亦不能诱导凋亡. E-cadherin的表达与食管鳞癌分化相关, Wu et al [22]研究表明ATRA可以在体外诱导E-cadherin表达上调.
DMSO(二甲基亚砜) 是一种简单的有机溶剂, 有多种生物学活性和广泛的医学用途, 而作为分化诱导剂可以诱导造血系统肿瘤细胞和实体瘤细胞分化. 国内研究发现DMSO以一种不同于维甲酸的作用机制, 对食管鳞癌细胞分化具有更强的诱导分化效应, 而无明显的毒副作用[36].
几位日本学者利用构建的p21腺病毒表达载体转染不同食管鳞癌细胞系, 证实异位p21能够引起食管癌细胞产生一系列变化如: 细胞周期阻滞于G1期, 恶性表型改变, 鳞状细胞分化标记物Involucrin表达增强3-5倍, 及产生分化依赖性凋亡等[4,5]. 因此可以推论p21将可能成为一种有效的食管鳞癌分化诱导剂.
部分食管鳞癌细胞系因不表达RAR-β而具有对RA的抗性, 细胞系的RA敏感性与RAR-β的表达和上调有关. 将RAR-β表达载体稳定转染食管癌细胞系, 可以抑制细胞生长、克隆形成、诱导凋亡和抑制COX-2表达, RA与RAR-β表达载体在分化诱导中具有协同作用[5].
过去人们曾在两个食管癌细胞系中加入不同浓度的GLA(γ-亚油酸), 发现7 d后细胞表型发生明显改变, 细胞凋亡达到顶峰. GLA介导的效应具有时间和剂量依赖性特点, 并随着细胞系分化程度而略有变化. 说明GLA也可以诱导分化.
总之, 经过数十年的研究, 在细胞分化和食管鳞癌的关系等方面取得了一定进展, 但尚有许多问题亟待解决. 如: 哪些是细胞分化关键和必须基因？其中又有哪些基因可以用作食管上皮特异性分化标记物？细胞分化调控的确切机制如何？诱导分化的最佳方案怎样？
基于细胞分化异常在食管鳞癌的发病学上占有十分重要的地位, 人们有理由相信, 随着细胞分化及调控机制研究的不断深入, 渴望在食管鳞癌癌变机制研究上有重大突破. 不同分化阶段的特异性基因产物直接关系到食管鳞癌发生机制的最后揭示、病理分级的明确诊断以及预后的判断. 而分化诱导技术可能作为治疗的基本策略, 将广泛应用于食管鳞癌的治疗.
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