研究快报 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-10-15; 11(10): 1649-1651
在线出版日期: 2003-10-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i10.1649
CO2气腹对肠道菌群生物学特性影响的实验研究
周丁华, 卫冰, 李宁, 黎介寿
周丁华, 卫冰, 中国人民解放军解放军二炮总医院普外科 北京市 100088
李宁, 黎介寿, 南京军区南京总医院全军普外研究所 江苏省南京市 210002
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30270406; 中国博士后科学研究基金资助项目, No. 中博基2001-14.
通讯作者: 周丁华, 100088, 北京市西城区新街口外大街16号, 中国人民解放军解放军二炮总医院普外科. zhoudh@sina.com
电话: 010-66343608 传真: 010-66343055
收稿日期: 2003-03-07
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-03-28
在线出版日期: 2003-10-15

目的

探讨CO2气腹对肠道菌群生物学特性的影响.

方法

采用细菌显微培养、通用引物PCR及细菌形态学检测技术对CO2气腹后大鼠肠道菌群进行细菌鉴定, 并观察其繁殖及群集性能.

结果

CO2气腹后肠道细菌繁殖能力最强的仍是大肠杆菌、乳酸杆菌、双岐杆菌和肠球菌, 并无特异性菌株生长与繁殖. 随着CO2气腹持续时间的延长及压力的增高, 肠道细菌群集率、细菌潜生体检出率逐渐增大. CO2气腹持续2 h后, 肠道菌群潜生体大量生长, 并可稳定传代, 有明显的群集现象.

结论

CO2气腹后肠道细菌繁殖能力及适应能力显著增强, 应充分估计其对抗生素的耐受特性.

关键词: N/A
引文著录: 周丁华, 卫冰, 李宁, 黎介寿. CO2气腹对肠道菌群生物学特性影响的实验研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(10): 1649-1651
N/A
N/A
Corresponding author: N/A
Received: March 7, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: March 28, 2003
Published online: October 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

随着腹腔镜技术及其配套器械的不断完善, 腹腔镜手术作为一种微创诊断和治疗手段, 其应用范围不断扩大, 手术时间也相应延长, CO2气腹对机体的影响也将更加显著[1-5]. CO2气腹对机体呼吸、循环系统影响的研究已有大量文献报道[6-9]. 本文采用PCR检测及细菌显微培养技术, 对CO2气腹后肠道菌群生物学特性进行了研究. 现将结果报告如下.

1 材料和方法
1.1 材料

健康Wistar大鼠40只, 体质量200-250 g, ♀20只, ♂20只. 随机分为低压组(气腹压1.33 kPa ), 中压组(气腹压2.0 kPa ), 高压组(气腹压2.67 kPa )以及对照组. 所有Wistar大鼠无消化道症状, 均未使用过抗生素及影响肠道菌群的药物. 试剂: 普通琼脂培养基; PCR试剂由上海生物技术服务公司提供; DNA提取试剂盒由中国人民解放军微生物监测中心提供; 试验菌株如大肠杆菌、变形杆菌、金色葡萄球菌、肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、沙门菌、志贺菌、肠杆菌、军团杆菌及其他细菌等均购自中国药品生物制品研究所; 标准菌液制备时将100 μL的蒸馏水加入1.5 mL离心管中, 用接种环挑取一环菌落于蒸馏水中, 震荡, 混匀, 备用; 引物合成由塞百盛生物技术公司合成与纯化.

1.2 方法

乙醚麻醉后, 平卧固定, 腹部酒精消毒, 闭合法建立CO2气腹, 气腹压力设定为1.33 kPa, 2.0 kPa, 2.67 kPa, 持续时间分别定为30 min, 1.0 h, 2.0 h, 4.0 h. 结束时经气腹针排出气体. 于气腹后次日取少许粪便标本制成混悬液, 震荡均匀, 涂片做革兰氏染色, 在Opton相差显微镜下观察标本细菌群集情况. 同时, 将混悬液分为三份, 一份分别稀释成103、106倍, 在37 °C琼脂糖平板上培养24 h后, 在Opton相差显微镜下观察菌群繁殖情况, 一份采用Shapiro的方法[3]进行细菌显微培养, 以显微摄像系统动态观察并记录菌群的繁殖、生长、运动的过程; 另一份做PCR检测. 行PCR检测时, 20 μL反应体系含引物FU1 10 pmol, FU2 10 pmol, 模板DNA 2 μL, dNTP各200 μmmol, Taq酶1.0 u. 94 °C变性30 s, 50 °C退火30 s, 72 °C延伸90 s, 共35个循环.

统计学处理 测定数据以mean±SD表示, 所得数据进行方差分析及配对t检验.

2 结果
2.1 肠道细菌PCR检测及鉴定

选择多种试验菌株进行特异性检测, 结果显示气腹后大鼠粪便中的大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌出现阳性结果, 未发现其他菌株特异性扩增产物.

2.2 肠道细菌镜检及鉴定

正常大鼠粪便中可见少量细菌的潜生体和繁殖体及短小杆菌, 不能传代生长. 气腹后大鼠粪便中可见大量细菌的潜生体和繁殖体, 其子代个体中仍有潜生体生长, 并有群集现象. 随着气腹持续时间的延长及气腹压力的增高, 肠道细菌群集率、细菌潜生体检出率逐渐增大; 气腹持续时间2 h后, 气腹低压组、中压组、高压组细菌群集率、细菌潜生体检出率均显著大于对照组(表1、表2).

表1 各组不同气腹持续时间的肠道细菌群集率变化(mean±SD, %).
组别n30 min1.0 h2.0 h4.0 h
低压组109.1±3.49.4±3.715.5±4.8a26.7±11.2b
中压组109.3±2.99.7±4.421.6±11.8b35.5±16.2b
高压组109.2±3.69.8±3.532.3±14.2b47.6±19.5b
对照组108.8±3.29.2±2.59.4±2.69.3±3.4
aP<0.05,
bP<0.01 vs 对照组.
表2 各组不同气腹持续时间的肠道细菌潜生体检出率变化(mean±SD, %).
组别n30 min1.0 h2.0 h4.0 h
低压组102.5±0.42.7±0.77.2±0.8a11.3±6.2b
中压组102.3±0.52.6±0.610.5±5.7b18.5±11.1b
高压组102.2±0.62.8±0.812.8±9.2b27.5±14.5b
对照组102.4±0.42.5±0.52.4±0.62.5±0.4
aP<0.05,
bP<0.01 vs 对照组.
2.3 肠道细菌显微培养

气腹后大鼠粪便细菌培养出大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌. 细菌的运动有灵活运动和定向运动两种方式. 气腹后大鼠粪便混悬液在37 °C细菌接种板上动态观察8 h后, 出现细菌潜生体多部位断裂增生、多部位出芽增生, 形成数个子代, 最终发育成繁殖体.

3 讨论

随着腹腔镜技术的广泛应用, CO2气腹对机体所产生的各种病理生理学改变受到众多学者的重视[10-14]. 本文应用PCR检测及细菌显微培养技术, 研究了CO2气腹后肠道菌群生物学特性. 结果显示, 大鼠气腹后肠道细菌繁殖能力最强的仍是大肠杆菌、乳酸杆菌、双岐杆菌和肠球菌, 并无特异性菌株生长与繁殖. 随着气腹持续时间的延长及气腹压力的增高, 肠道细菌群集率、细菌潜生体检出率逐渐增大. 气腹持续2 h后, 肠道菌群潜生体大量生长, 并可稳定传代, 有明显的群集现象. 气腹后肠道菌群的上述特征性变化, 一方面可能是腹腔内压力增高导致内脏血管收缩, 静脉回流减少, 致使心脏的前负荷降低[15-17]. 同时, 由于腹内高压机械性压迫大鼠肠道毛细血管床, 反射性引起血管血流阻力增高导致肠道黏膜血流灌注不足, 进而引起肠黏膜淤血水肿、肠黏液pH值改变, 有利于肠道细菌的繁殖与群集; 另一方面可能是腹内高压导致机体全身或肠道局部免疫功能下降[18,19]. 加之肠道细菌有较强的传代繁殖能力和特殊的运动方式, 使得肠道菌群得以大量繁殖与生长.当肠道环境有利于细菌繁殖时, 细菌潜生体迅速发育成多个繁殖体, 当不利于细菌繁殖时, 细菌繁殖体又迅速转变成为潜生体. 气腹后肠道细菌的上述生物学特征变化使得其对渗透压、湿度、酸碱性等不利环境有较强的耐受性.

CO2气腹不仅促使肠道细菌大量繁殖与群集, 而且还有利于肠道细菌移位和播散[20,21], 且肠道细菌繁殖、群集、移位和播散与气腹压力及持续时间密切相关.因此, 实施腹腔镜手术时, CO2气腹压力应尽量控制在既能满足手术要求, 又能对机体肠道菌群产生较小影响的水平. 实施气腹时保持腹肌良好的松弛, 有助于维持和降低腹腔内压. 此外, 根据患者与手术需要, 采取术中间歇放气可缓解高腹内压对腹腔内血管的压迫, 维持肠道黏膜内环境的相对稳定. 腹腔镜手术后, 要充分估计到气腹后肠道细菌对抗生素的耐受特性, 使用兼顾细菌因素和宿主因素两方面的药物, 以降低肠道细菌群集率, 抑制其潜生体的形成, 阻止肠道细菌移位和播散.

1.  Himal HS. Minimally invasive (laparoscopic) surgery. Surg Endosc. 2002;16:1647-1652.  [PubMed]  [DOI]
2.  Scott-Conner CE. Laparoscopic gastrointestinal surgery. Med Clin North Am. 2002;86:1401-1422.  [PubMed]  [DOI]
3.  Weber JC, Navarra G, Habib NA, Bachellier P, Jaeck D. Laparoscopic radiofrequency-assisted liver resection. Surg Endosc. 2003;17:834.  [PubMed]  [DOI]
4.  Ponsky LE, Cherullo EE, Banks KL, Greenstein M, Streem SB, Klein EA, Zippe CD. Laparoscopic radical nephrectomy: incorporating advantages of hand assisted and standard laparoscopy. J Urol. 2003;169:2053-2056.  [PubMed]  [DOI]
5.  Kalil AN, Mastalir ET. Laparoscopic hepatectomy for benign liver tumors. Hepatogastroenterology. 2002;49:803-805.  [PubMed]  [DOI]
6.  Schulze S, Lyng KM, Bugge K, Perner A, Bendtsen A, Thorup J, Nielsen HJ, Rasmussen V, Rosenberg J. Cardiovascular and respiratory changes and convalescence in laparoscopic colonic surgery: comparison between carbon dioxide pneumoperitoneum and gasless laparoscopy. Arch Surg. 1999;134:1112-1118.  [PubMed]  [DOI]
7.  Latimer FG, Eades SC, Pettifer G, Tetens J, Hosgood G, Moore RM. Cardiopulmonary, blood and peritoneal fluid alterations associated with abdominal insufflation of carbon dioxide in standing horses. Equine Vet J. 2003;35:283-290.  [PubMed]  [DOI]
8.  Hawasli A, Oh H, Schervish E, Frontera R, Gonsherova I, Khoury H. The effect of pneumoperitoneum on kidney function in laparoscopic donor nephrectomy. Am Surg. 2003;69:300-303.  [PubMed]  [DOI]
9.  Rosin D, Rosenthal RJ. Adverse hemodynamic effects of intraabdominal pressure- is it all in the head? Int J Surg Investig. 2001;2:335-345.  [PubMed]  [DOI]
10.  Holthausen UH, Nagelschmidt M, Troidl H. CO2 pneumoperitoneum: what we know and what we need to know. World J Surg. 1999;23:794-800.  [PubMed]  [DOI]
11.  Agostini A, Robin F, Jais JP, Aggerbeck M, Vilde F, Blanc B, Lecuru F. Impact of different gases and pneumoperitoneum pressures on tumor growth during laparoscopy in a rat model. Surg Endosc. 2002;16:529-532.  [PubMed]  [DOI]
12.  Hanly EJ, Mendoza-Sagaon M, Murata K, Hardacre JM, De Maio A, Talamini MA. CO2 Pneumoperitoneum modifies the inflammatory response to sepsis. Ann Surg. 2003;237:343-350.  [PubMed]  [DOI]
13.  Tan M, Xu FF, Peng JS, Li DM, Chen LH, Lv BJ, Zhao ZX, Huang C, Zheng CX. Changes in the level of serum liver enzymes after laparoscopic surgery. World J Gastroenterol. 2003;9:364-367.  [PubMed]  [DOI]
14.  Wildbrett P, Oh A, Naundorf D, Volk T, Jacobi CA. Impact of laparoscopic gases on peritoneal microenvironment and essential parameters of cell function. Surg Endosc. 2003;17:78-82.  [PubMed]  [DOI]
15.  Yokoyama Y, Alterman DM, Sarmadi AH, Baveja R, Zhang JX, Huynh T, Clemens MG. Hepatic vascular response to elevated intraperitoneal pressure in the rat. J Surg Res. 2002;105:86-94.  [PubMed]  [DOI]
16.  Gutt CN, Schmandra TC. Portal venous flow during CO2 pneumoperitoneum in the rat. Surg Endosc. 1999;13:902-905.  [PubMed]  [DOI]
17.  Schmandra TC, Kim ZG, Gutt CN. Effect of insufflation gas and intraabdominal pressure on portal venous flow during pneumoperitoneum in the rat. Surg Endosc. 2001;15:405-408.  [PubMed]  [DOI]
18.  Gupta A, Watson DI. Effect of laparoscopy on immune function. Br J Surg. 2001;88:1296-1306.  [PubMed]  [DOI]
19.  Chekan EG, Nataraj C, Clary EM, Hayward TZ, Brody FJ, Stamat JC, Fina MC, Eubanks WS, Westcott CJ. Intraperitoneal immunity and pneumoperitoneum. Surg Endosc. 1999;13:1135-1138.  [PubMed]  [DOI]
20.  Ozmen MM, Col C, Aksoy AM, Tekeli FA, Berberoglu M. Effect of CO2 insufflation on bacteremia and bacterial translocation in an animal model of peritonitis. Surg Endosc. 1999;13:801-803.  [PubMed]  [DOI]
21.  Matsumoto T, Tsuboi S, Dolgor B, Bandoh T, Yoshida T, Kitano S. The effect of gases in the intraperitoneal space on cytokine response and bacterial translocation in a rat model. Surg Endosc. 2001;15:80-84.  [PubMed]  [DOI]