多种因子在门脉高压大鼠结肠黏膜中的表达

摘要

目的

探讨多种因子在门脉高压大鼠结肠黏膜中的表达及其意义.

方法

实验组大鼠行门静脉两步结扎加左肾上腺静脉结扎; 应用免疫组化SP染色法检测iNOS、ecNOS、ET-1、及TNF-α在大鼠结肠黏膜中的表达情况.

结果

实验组iNOS、ET-1、及TNF-α表达较对照组增强(2.97±0.51 vs 2.33±0.76; 2.01±0.32 vs 1.38±0.74; 2.57±0.64 vs 1.67±0.36, P<0.05), ecNOS无明显变化(2.01±0.69 vs 1.87±0.56, P>0.05).

结论

iNOS、ET-1、TNF-α参与门脉高压大鼠结肠黏膜局部病变.

关键词: N/A

N/A

N/A

Corresponding author: N/A

Received: April 3, 2003
Revised: April 20, 2003
Accepted: May 19, 2003
Published online: October 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

随着门脉高压性结肠病变(portal hypertensive colopathy, PHC)[1]概念的提出, 局部体液因子的改变在PHC病因学中的作用渐受关注, 但有关此方面的报道甚少[2]. 本文选取具有不同作用的一氧化氮合酶(NOS)、内皮素1(ET-1)及肿瘤坏死因子α(TNF-α), 应用免疫组化技术检测他们在门脉高压大鼠结肠黏膜局部的表达情况, 以期探讨门脉高压大鼠结肠黏膜病变中体液因子的变化及意义.

1 材料和方法

1.1 材料

(1)动物与分组: 20只♂SD大鼠 (225-275 g, 购自中南大学湘雅医学院实验动物中心) 随机分成两组, 实验组行门静脉两步法结扎加左肾上腺静脉结扎手术; 对照组为假手术组. (2)试剂: 兔抗大鼠ecNOS多克隆抗体、兔抗大鼠iNOS多克隆抗体、兔抗大鼠ET-1多克隆抗体、山羊抗大鼠TNF-α多克隆抗体、通用型S-P染色试剂盒、生物素标记兔抗山羊IgG染色试剂盒及DAB购自北京中山生物技术有限公司.

1.2 方法

(1)动物模型制备: 对Tanoue et al [3]方法加以改进, 应用门静脉两步法结扎加左肾上腺静脉结扎制备门脉高压大鼠模型. (2)门静脉完全结扎后2 wk, 将两组大鼠麻醉后开腹, 找到肠系膜上静脉, 剪一小口, 将一根充满生理盐水的硬膜外导管置入静脉近端, 以鼠右心房水平为"0"点, 测定门静脉压力. 其后小心切除小段乙状结肠, 常规固定、脱水、透明、石蜡包埋. (3) 免疫组化SP染色法 抗原修复(NOS、ET-1应用EDTA煮沸20 min; TNF-α应用柠檬酸缓冲液煮沸20 min), 余同说明; DAB显色; PBS代替一抗作阴性对照. (4)判断标准: 反应产物的染色强度以光密度值(optical density, OD值)表示. 选取结肠不同部位(黏膜、黏膜下层、肌层), 每一部位随机选5处, 应用计算机辅助HPIAS-1000图像分析系统测定反应产物的A值(若无记为0), 每一标本取平均A值.

统计学处理 应用SPSS10.0 for window统计软件分析, 检测数据以表示, 计量资料组间比较采用t检验, P<0.05为差异有显著性.

2 结果

2.1 一般情况及静脉压力

实验组大鼠腹壁血管、肠系膜血管扩张较对照组明显; 实验组大鼠有两只可见腹腔内有少量腹水生成, 余大鼠及对照组未见明显腹水生成; 实验组大鼠门静脉压力较对照组明显升高(20.90±3.27cm H₂O vs 11.43±1.55 cm H₂O, P<0.01).

2.2 NOS表达情况

NOS表达阳性细胞为胞质内棕黄色颗粒, 可见于黏膜上皮、肠腺腺腔、黏膜下层血管内皮, 同时在黏膜表面及肌层也可见黄染产物. 实验组中iNOS的表达强度明显高于对照组(2.97±0.51 vs 2.33±0.76, P<0.05), 但ecNOS的表达强度两组间无明显差异(2.01±0.69 vs 1.87±0.56, P>0.05).

2.3 ET-1表达情况

阳性表达为棕黄色颗粒, 主要见于黏膜下层、黏膜上皮, 黏膜表面及肌层亦可见少量黄染.实验组表达强度高于对照组(2.01±0.32 vs 1.38±0.74, P<0.05).

2.4 TNF-α表达情况

阳性表达于黏膜层可见黄染产物, 阳性细胞为胞质内可见棕黄色颗粒; 实验组TNF-α表达强度较对照组明显增高(2.57±0.64 vs 1.67±0.36, P<0.01).

3 讨论

门脉高压症肠黏膜病变发病机制至今尚不清楚. 既然分流手术可使PHC好转, 提示门静脉压力与PHC间有一定相关关系[4-6], 然而也有研究发现PHC与HVPG无明显相关[7], 故在PHC形成中门静脉压力升高可能并非惟一因素. 随着对门静脉高压症胃黏膜病变认识的加深, 血管活性因子等体液因子在PHC中的作用受到关注, 初步研究提示局部体液因子参与PHC的发展进程[2]. 有学者研究认为门静脉结扎制作的大鼠门脉高压模型可用于PHC的研究[2], 本研究中门静脉完全结扎后2 wk, 实验组大鼠门静脉压力较对照组明显升高, 认为门脉高压大鼠模型制作成功.

内源性NO是一种强烈的血管舒张因子, 也是新型的细胞内信使和神经递质, 在机体的病理生理过程中有重要作用[8]. 由于NO稳定性差, 半衰期甚短, 直接测定十分困难, 作为合成NO的惟一限速酶NOS成为研究NO的重要手段.本研究中, 实验组结肠中iNOS的表达强度明显高于对照组(P<0.05), 但ecNOS在结肠中的表达强度两组间无明显差异(P>0.05). 其升高可能是由于升高的门脉压力使肠道回流受阻, 肠道淤血、水肿, 肠黏膜屏障受损, 毒素物质移位、入血, 同时由于回流受阻, 高毒素血液在肠局部较长时间的刺激血管内皮等, 使iNOS生成增加, 这必然使NO生成增加, 致血管扩张, 加重淤血. 尚有学者认为NO使平滑肌舒张, 调节胃肠动力[9], NO升高使结肠运动功能减弱, 延长了黏膜与损伤因素接触时间, 而加剧结肠黏膜损伤.本研究中结肠处ecNOS无明显变化, 可能在PHC不起重要作用.

ET-1可通过其受体起多效性的生物作用[10] , 对于门脉高压症肠道黏膜中ET-1表达情况尚未见报道. 本研究中, ET-1在实验组表达强度高于对照组. 一方面, 在通常情况下, 扩血管物质与缩血管物质的释放和激活处于一动态平衡, 以此提供一相对稳定的微环境, ET-1升高可保持局部微环境相对稳定; 另一方面, 由于ET-1尚可诱导黏膜损伤[11], 过量表达的ET-1必使肠道黏膜进一步受损.

TNF-α是一种细胞毒性蛋白, 研究表明TNF-α不仅可激活NOS基因[12,13], 也可激活ET-1基因[14]. 本研究中TNF-α在实验组表达强度高于对照组, 升高可能为回流受阻, 水肿、淤血使肠黏膜屏障受损, 毒素物质移位, 诱使肠道黏膜局部TNF-α生成增加. TNF-α升高既可激活ET-1、NOS基因, 而参与门脉高压症结肠黏膜病变过程; 同时TNF-α尚可增加血管通透性[15], 其升高也加重肠壁水肿、损伤黏膜屏障而加重局部病变.

由此可见, 门脉高压结肠黏膜病变是多因素共同作用的结果, 其机制尚有待进一步阐明.

备注

$[Footnotes]

参考文献

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