消化管发育中上皮细胞凋亡研究进展

摘要

细胞凋亡是在某些生理或病理条件下, 细胞接受到某种信号的触发后主动参与并遵循一定程序的较慢的死亡过程. 消化管在发育过程中, 消化管上皮广泛存在着细胞凋亡现象. 胎鼠肠上皮中凋亡小体主要分布在近上皮的肠腔面, 但在食管中则广泛分布于上皮各层. 食管, 十二指肠和结肠上皮凋亡小体密度的峰值分别出现在胚胎12 d、15 d、16 d, 食管上皮的凋亡小体密度峰值明显高于十二指肠和结肠. 细胞凋亡对消化管形态发生起着重要的作用, 是适应发育进程的需要, 在消化管发育过程中, 细胞自然凋亡规律一旦失常, 个体即不能正常发育或发生畸形. 消化管发育中上皮细胞凋亡受到多种因素的调控, 其中基因调控起着关键的作用. Bcl-2家族、p53和c-myb等多种基因以及细胞因子共同参与了其调控. 胚胎发育过程中发生的增生和凋亡, 并不是随机出现的, 而是发生在胚胎发育过程特定部位和特定时间, 并有着严格的时空程序.

关键词: N/A

N/A

N/A

Corresponding author: N/A

Received: May 22, 2002
Revised: September 10, 2002
Accepted: October 22, 2002
Published online: October 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

细胞凋亡(apoptosis)首先是由英国病理学家Kerr et al在1972年提出的, 用以描述一种在形态学上有别于细胞坏死(necrosis)的细胞死亡过程. 细胞凋亡是在某些生理或病理条件下, 细胞接受到某种信号的触发后主动参与并遵循一定程序的较慢的死亡过程. 他是机体的一种基本生理机制, 贯穿于机体的整个生命活动过程[1,2]. 关于胚胎消化管上皮发生的调控机制, 多认为与肠上皮细胞增生与凋亡, 肠壁平滑肌的限制作用, 间充质及某些活性物质的诱导作用等因素有关[3-6]. 细胞凋亡在消化管发育过程中具有重要的生物学意义. 消化管发育中上皮细胞凋亡受到多种因素的调控, 其中基因调控起着关键的作用. Bcl-2家族、p53和c-myb等多种基因以及细胞因子共同参与了其调控.

1 消化管发育中的细胞凋亡

1.1 胎粪小体

早在十九纪末就有人报道胚胎发育过程中肠上皮细胞中有颗粒状的包含物, 被称为胎粪小体(meconium corpuscle), 认为是肠上皮细胞吸收肠腔内物质形成的[7]. 1980年代通过大鼠和人胚胎结肠发生的电镜观察, 揭示了胎粪小体实属肠上皮细胞凋亡崩解后所形成的有膜被的凋亡小体(apoptosis bodies), 可被邻近的上皮细胞吞噬或脱入肠腔内[8,9]. 胚胎发育至一定阶段, 肠腔表面的上皮细胞核固缩浓染, 细胞退变脱落[10]. 凋亡细胞在电镜下有其形态特征, 早期细胞凋亡表现为核固缩并凝结成块; 晚期时核染色质固缩在核膜周边成半月状或环状, 内质网极度扩张, 线粒体改变不明显. 以后凋亡细胞形成多个有膜包裹的凋亡小体[11-14]. 用TUNEL(In-situ dTdT-mediated dUTP nick end labeling)法可原位标记凋亡细胞的核及含核碎片的凋亡小体. Hall et al [15]还在光镜下计数小鼠HE染色切片中胃肠上皮的凋亡小体. 汪维伟et al [16]报道在胎鼠HE染色石蜡切片中见消化管上皮内凋亡小体直径在1.20 μm-6.25 μm, 圆形, 内含1至多个深染核碎片和强嗜酸性胞质或仅含强嗜酸性胞质, 外有清楚晕环, 在未见淋巴细胞浸润的胚胎消化管上皮中较易识别, 其分布与TUNEL法原位标记的凋亡细胞在上皮中分布一致. 胎鼠肠上皮中凋亡小体主要分布在近上皮的肠腔面, 但在食管中则广泛分布于上皮各层. 食管, 十二指肠和结肠上皮凋亡小体密度的峰值分别出现在胚胎12 d、15 d、16 d, 食管上皮的凋亡小体密度峰值明显高于十二指肠和结肠.

1.2 凋亡

凋亡不是可有可无, 无规律的现象, 而是多细胞动物生命活动过程中不可缺少的部分[17]. 一方面是个体正常发育成熟过程所必需的, 另一方面也是动物维持个体正常细胞数量所必须的. 在消化管发育过程中的凋亡具有重要的生物学意义, 首先是适应发育进程的需要. 在胎鼠发育过程中肠上皮近游离面和食管上皮各层均有大量凋亡小体出现, 说明细胞凋亡在消化管上皮发生中起着重要作用. 在胚胎发育至人胚第7-8 wk以及鼠胚第13-14 d时, 肠上皮细胞大量分裂增生, 上皮变为复层, 肠腔变小或"闭塞"; 随后复层上皮内的细胞间出现次级腔, 并渐与原发腔相通连并融合, 肠腔扩大, 是肠绒毛形成的基础. 原发腔和次级腔的扩大, 肠绒毛的形成以及复层上皮向单层上皮的转变中均依赖于细胞凋亡. 消化管的发育是在消化管上皮细胞的增生与自然凋亡的动态平衡中进行的. 可以说, 没有凋亡就没有消化管的发育. 其次, 在消化管发育过程中, 细胞自然凋亡规律一旦失常, 个体即不能正常发育或发生畸形, 例如, 先天性肠狭窄或闭锁, 就是由于应该凋亡的细胞没有凋亡而造成的; 而不应该凋亡的细胞出现凋亡则可造成如气管-食管瘘这样的畸形. 此外, 胚胎消化管发育过程中存在广泛的细胞迁移现象也可以通过凋亡清除异常迁移的细胞, 以保证胚胎的正常发育[18]. 但也有人认为细胞凋亡在结肠上皮的组织发生中意义不大[19].

2 消化管发育中凋亡相关基因的表达和调节

2.1 消化管上皮发生中的凋亡分子机制

由于分子生物学的飞速发展, 近年来有关消化管上皮发生中凋亡分子机制的研究取得了可喜的进展, 有关凋亡的新基因不断被发现. Bcl-2[20,21] (B-cell lymphoma/leukemia-2)基因是1984年Tsujimoto et al从滤泡性淋巴瘤中分离出来的一种癌基因. Bcl-2蛋白是调节凋亡的关键元件, 他通过抑制半胱天冬蛋白酶Caspase (又称为死亡蛋白酶)激活所需的配体(adaptor)活性而使细胞生存, 所以Bcl-2又称生存蛋白. 基因Bcl-2及Bcl-2蛋白不影响细胞的增生率而是抑制或阻断多种因素引起的细胞凋亡. 随着研究的深入, Bcl-2基因家族不断扩大, 他们有的对凋亡起抑制作用, 例如: Bcl-2、Bcl-xl、A1、Mcl-1、ced-9等; 有的则为凋亡的促进者, 例如: Bcl-x、Bax、Bad、Mcl-1等. 这些基因均与Bcl-2有较高同源性. Novack和Korsmeyer et al [22]在C3HхC57BL/6F1小鼠中观察到: 在胚胎14.5 d时, 肠上皮细胞尚未分化, Bcl-2在肠管上皮中所有的细胞均有高水平表达; 到胚胎16.5时, 肠管已有绒毛形成, 但所有肠管上皮细胞继续表达Bcl-2, 其表达水平可能比14.5 d时有所下降; 到胚胎18.5 d时, 绒毛更明显, 细胞已经开始分化, Bcl-2表达于是局限在绒毛基底部. Bcl-2表达于全部未分化肠上皮细胞, 却在发育成熟的绒毛里局限表达于未分化祖细胞带. 研究表明Bcl-2在人胚胎组织中表达比在成年后更为广泛. 因此, 未成熟细胞表达Bcl-2是为了克服特殊时期的细胞凋亡. 尽管Bcl-2在正常胚胎中有广泛表达, 但在Bcl-2缺陷小鼠中除了肾脏以外的许多器官仍正常发育, 这可能是由于Bcl-2相关分子家族在胚胎发生过程中提供了过剩的死亡抑制[22]. Vachon 和Cardin et al [23]利用原位末端标记(in situ terminal uridine deoxynucleotidy1 nick-end labelling, ISEL)方法检测人胚胎9-20 wk空肠发育过程中肠细胞的凋亡. 在9-17 wk时肠细胞凋亡不明显. 但是, 从18 wk开始, ISEL阳性细胞可在绒毛顶部上皮规则地检测到. 利用免疫荧光方法发现Bcl-2蛋白家族, 包括Bcl-2、Bcl-X(L)、Mcl-1、Bax、Bak、Bad六个同系物和一个非同系物分子Bag-1全部表达于19-20 wk肠上皮细胞. 而Bcl-2同系物在18-20 wk以前沿着肠腺-绒毛轴上皮中呈区域化的梯度表达. Western blot分析表明在肠腺-绒毛轴形态发生过程中, Bcl-2同系物表达的调节是与其区域化的上皮表达相平行的.

2.2 c-myb是凋亡调节有关基因中的成员之一

c-myb是凋亡调节有关基因中的成员之一, 他有直接调节Bcl-2基因转录的作用, 在胃肠的胚胎发育中, c-myb和Bcl-2经常是联合表达. c-myb在胎鼠结肠黏膜早期中有所表达, 在鼠和人的结肠上皮中表达一直持续到成年. Zorbas et al [24]等用c-myb基因剔除小鼠观察到: 在结肠上皮腔面和腺体中的细胞凋亡都增加, 而Bcl-2表达显著减少. 因此认为c-myb是通过控制Bcl-2的转录而调节凋亡的. c-myb在成年小鼠小肠上皮中的表达水平与结肠表达相似. 但是, 在发育过程中, c-myb基因缺失小鼠在胚胎14 d时, 小肠Bcl-2的表达却不受影响. 因此, 虽然Bcl-2可能在结肠中部分被c-myb所调节, 但这种情况不出现在小肠中.

2.3 p53是一种典型的抑癌基因

p53是一种典型的抑癌基因, 对细胞生长起负调节作用(negative regulation), 促进细胞凋亡[25-27]. 大量文献表明p53基因虽可诱导细胞凋亡, 但并非所有细胞的凋亡过程均必须. 小鼠肺发育的任何阶段均未见p53的阳性表达, 对不同发育阶段的人胎肺组织的检测也出现同一结果[28]. p53缺失小鼠肠腺中细胞凋亡水平保持正常[29]. 在小鼠胚胎14.5 d时, 所有复层肠上皮均表达p53, 到胚胎16. 5天时, 肠隐窝里的上皮细胞表达p53明显强于覆盖绒毛上的细胞; 形成黏膜下层的中胚层细胞仅表达低水平的p53mRNA. 在胎鼠肠腺/绒毛轴形成后, p53的表达就局限于腺上皮[30]. 胚胎发育过程中, p53高水平表达于未分化和增生细胞中. 因此p53可能与细胞分化过程调节及细胞成熟有关[31]. p53基因家族, 包括p63和p73, 他们具有相互重叠的功能又各有其不同的特点. 这些家族成员都具有相似的结构, 此结构在诱导发育凋亡中具有重要作用. 与正常小鼠相比, 在p53缺失小鼠的食管复层上皮有p63高表达, 因此p63表达可能与p53缺陷有关[32].

2.4抑制凋亡的基因 Survivin et al [33]是IAP基因家族成员之一

抑制凋亡的基因 Survivin et al [33]是IAP基因家族成员之一, 在胎鼠11.5 d胃肠管上皮中有表达. 同样, 在人胎胃和肠腺体底部表达水平很高, 而在绒毛上皮中没有表达. 因此可见, Survivin基因在胃肠发育过程中具有重要作用. 此外, Merrittti的研究结果显示啮齿类动物胃肠道上皮细胞在转化的原癌基因p53的介导下, 细胞凋亡的数量增加. 将原癌基因c-myc, c-Ha-ras转染第14 d大鼠胚胎细胞后, 在放射诱导下, 转染c-myc或c-Ha-ras和c-myc的胚胎细胞凋亡数量增加, 而只转染c-Ha-ras的胚胎细胞有抗放射诱导细胞凋亡的作用.

3 消化管发育中与细胞凋亡相关的细胞因子的调节

细胞因子与消化管发育中凋亡密切相关. 文献报道, 表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和转化生长因子-α(transforming growth factor-α, TGF-α)在胚胎生长发育过程中, 通过与相应膜受体结合具有调控上皮细胞生长的作用. EGF在肠上皮中有阻止TGF-β诱导的凋亡的作用. Iwanaga et al 对成年大鼠肠上皮细胞调亡的研究, 见绒毛顶部的细胞发生凋亡, 可能与巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子的化学作用等因素有关. TGF-β是一种多功能多肽, 调节肠上皮细胞增生、移行、分化及细胞外基质的形成. Barnard报告了TGF-β可能在上皮细胞离开增生区时, 阻止细胞增生并维持其最终的分化状态. TGF-β还对体外培养IEC-6肠上皮细胞增生有强烈的抑制作用. TGF-β可以诱导结肠上皮细胞凋亡, 免疫组化研究表明, TGF-β1主要表达于小肠绒毛顶部, 而在结肠组织中, 则主要表达于结肠腺顶部不再分裂的细胞. 在腺顶部的细胞中TGF-β的阳性表达和Bcl-2的阴性表达则表明这些细胞处于凋亡状态中.

4 细胞增生与细胞凋亡

细胞分裂增生与细胞凋亡, 从功能的角度来看是两个截然相反的生物学现象. 然而近年来随着人们对这两个过程研究的深入, 有越来越多的证据表明: 这两个原来截然相反的过程, 实际上有着非常密切的联系. Vachon et al [23]报道人胚胎肠细胞的凋亡与腺体-绒毛轴的细胞增生和分化有关. 发育生物学认为, 许多精细器官的胚胎发生, 无1例外地包含着细胞凋亡的机制. 而胚胎发育过程中发生的增生和凋亡, 并不是随机出现的, 而是发生在胚胎发育过程特定部位和特定时间, 并有着严格的时空程序. 关于二者的相互影响和联系, 尚未见到系统的报道.

关于胚胎肠上皮凋亡的机制, Sbarbati et al认为与表层上皮细胞血供不足有关; Knox et al 认为远离基底层的细胞可能因接受基膜的生存信息减弱而易发生凋亡[26]; Iwannaga et al则报道成体大鼠小肠绒毛固有层的巨噬细胞能诱导上皮细胞凋亡. 更多资料表明, 凋亡在胚胎消化管发育过程中受多种基因和生长因子调节. 随着分子生物学的迅速发展, 已发现了许多与细胞凋亡有关的调控基因, 初步说明细胞凋亡是受基因控制的, 是主动连续的程序化反应. 但是, 凋亡的调控机制是个十分复杂的过程, 许多新基因还有待发现, 许多调节因素以及基因间的相互作用关系尚需研究.

备注

$[Footnotes]

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