基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-10-15; 11(10): 1488-1491
在线出版日期: 2003-10-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i10.1488
氧化苦参碱对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化I, III, IV型胶原表达的影响
陆伦根, 曾民德, 茅益民, 李继强, 邱德凯, 杨文卓, 贾一韬, 曹爱平
陆伦根, 曾民德, 茅益民, 李继强, 邱德凯, 杨文卓, 贾一韬, 曹爱平, 上海第二医科大学附属仁济医院 上海市消化疾病研究所 上海市 200001
陆伦根, 男, 1965-11-09, 江苏省扬州市人, 博士, 副教授, 副主任医师, 主要从事消化系疾病尤其是肝脏疾病的基础和临床研究. 发表论文50篇, 主编专著2部, 参编专著近20篇, 获上海市和教育部科技成果奖3项.
基金项目: 上海市医学发展基金重点研究项目, No. 99ZDI001; 1999年中华肝病学会中青年肝病科研基金.
通讯作者: 陆伦根, 200001, 上海市, 上海第二医科大学附属仁济医院上海市消化疾病研究所. lulungen@online.sh.cn
电话: 021-63364118 传真: 021-63364118
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-03-25
在线出版日期: 2003-10-15

目的

研究口服氧化苦参碱对CCl4诱导的大鼠肝纤维化组织I, III, IV型胶原表达的影响.

方法

♂Wistar大鼠140只随机分为正常对照组(n = 20)、CCl4模型组(n = 30)、氧化苦参碱预防低剂量组(n = 30)、中剂量组(n = 30)和高剂量组(n = 30). 氧化苦参碱低、中、高剂量组大鼠氧化苦参碱的用量分别为30, 60, 100 mg/kg, 每日灌胃1次, 共12 wk. 肝组织学检查观察肝组织炎症和纤维化程度, 免疫组化观察肝组织中I, III和IV型胶原的表达, 电镜观察肝组织的超微结构变化.

结果

组织学检查结果表明对照组肝脏炎症和纤维化程度明显高于氧化苦参碱预防组; 免疫组化检测表明预防对照组大鼠肝内有大量I, III和IV型胶原沉积, 其中III型和IV型胶原的沉积形成肝窦毛细血管化, 而氧化苦参碱预防组肝内胶原沉积较少, 无明显的肝窦毛细血管化形成; 电镜学检查证明氧化苦参碱预防组肝细胞损伤程度较对照组显著减轻.

结论

口服氧化苦参碱可减少CCl4诱导的大鼠肝纤维化组织中胶原的表达, 对肝纤维化有预防作用.

关键词: N/A
引文著录: 陆伦根, 曾民德, 茅益民, 李继强, 邱德凯, 杨文卓, 贾一韬, 曹爱平. 氧化苦参碱对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化I, III, IV型胶原表达的影响. 世界华人消化杂志 2003; 11(10): 1488-1491
Effect of oxymatrine on expressions of type I, III, IV collagen in CCl4 induced liver fibrosis in rats
Lun-Gen Lu, Min-De Zeng, Yi-Min Mao, Ji-Qing Li, De-Kai Qiu, Wen-Zhuo Yang, Yi-Tao Jia, Ai-Ping Cao
Lun-Gen Lu, Min-De Zeng, Yi-Min Mao, Ji-Qing Li, De-Kai Qiu, Wen-Zhuo Yang, Yi-Tao Jia, Ai-Ping Cao, Shanghai Institute of Digestive Disease, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001, China.
Supported by: the key project of Shanghai Medical Development Foundation, No. 99ZDI001 and grants from 1999 Liver Diseases Research Fund for Young Scholars of Chinese Liver Diseases Association.
Corresponding author: Lun-Gen Lu, Shanghai Institute of Digestive Disease, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001, China. lulungen@online.sh.cn
Received: March 8, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: March 25, 2003
Published online: October 15, 2003

AIM

To study the effect of oral oxymatrine on expressions of type I, III, IV collagen in rat liver fibrosis induced by CCl4.

METHODS

140 male Wistar rats were randomly divided into normal control group (n = 20), CCl4 group (n = 30), and oxymatrine-treated group including low-dose subgroup (n = 30), median-dose subgroup (n = 30), and high-dose subgroup (n = 30). Low, median, and high-dose oxymatrine subgroups were given 30, 60 and 100 mg/kg oxymatrine by daily gastrogavage for 12 wk, respectively. Inflammation and fibrosis degree of liver tissues were examined by hematoxylin-eosin staining. Expressions of type I, III, IV collagen were detected by immunohistochemistry, and ultrastructural changes were observed by electron microscopy.

RESULTS

Liver histologic examination showed that the degree of liver inflammation and fibrosis were more serious in control group than in oxymatrine-treated groups. In control group, the amounts of collagen type I, III, IV deposits were observed, and type III and IV collagen deposits were the main constitutes of hepatic sinusoid capillarization. But in oxymatrine-treated groups, type I, III, IV collagen deposits were less, hepatic sinusoid capillarization was not obviously found. Electron microscopy showed that the degree of hepatocyte injury was more serious in control group than in oxymatrine-treated groups.

CONCLUSION

Oral oxymatrine might decrease expression of type I, III, IV collagen in rat liver fibrosis model induced by carbon tetrachloride, suggesting oral oxymatrine might have anti-fibrogenic effect.

Key Words: N/A
0 引言

氧化苦参碱是从中药苦参和苦豆子中提取的一种生物碱, 近年来人们在研究中发现其有效成分氧化苦参碱具有保护肝细胞、抗乙型和丙型肝炎病毒和抗肝纤维化等作用[1-15]. 我们观察了氧化苦参碱对肝纤维化动物模型肝组织中I, III, IV型胶原的表达变化, 为临床应用氧化苦参碱治疗肝纤维化提供实验依据.

1 材料和方法
1.1 材料

氧化苦参碱纯品由宁夏药物研究所提供, 批号: 971201. 使用前用0.01 mol/L PBS配成为100 g/L的母液, 分装后-70 °C冰箱保存备用. 多克隆兔抗大鼠I、III和IV型胶原抗体为Sigma公司产品. 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒(UltraSensitiveTMS-P Kit)购于福州迈新试剂公司. ♂Wistar大鼠140只, 清洁级, 体质量120-140 g, 购于中科院上海实验动物中心. 动物自由进食与饮水, 在整个实验过程中房间定期消毒.

1.2 方法

将动物随机分为正常对照组20只, 不加处理, 自由进食与饮水; CCl4模型组30只, CCl4用花生油配成400 ml/L, 初次剂量为5 ml/kg, 以后为2 ml/kg皮下注射, 2次/wk, 共进行12 wk. 本组用于观察造模过程中, 肝组织纤维化进展情况. 在4, 6, 8, 12 wk时, 分批处死, 每次随机3只, 观察肝组织学病理变化; 氧化苦参碱预防组90只, 低剂量组30只, 中剂量组30只, 高剂量组30只, 在注射CCl4的同时口服氧化苦参碱, 分别为30, 60和100 mg/kg, 1次/d, 共进行12 wk. 灌胃给药容积为10 ml/kg. 动物处死后取右叶肝组织, 用40 g/L中性甲醛溶液固定, 经系列乙醇脱水、二甲苯透明后, 石蜡包埋. 切成5 um厚切片. HE染色后, 光镜下观察肝纤维化程度. 肝炎症活动度和纤维化程度按1995年全国诊断标准进行. 免疫组织化学根据S-P免疫组化试剂盒说明进行. 检测肝组织内I, III和IV型胶原表达. 光镜下观察, 棕褐色为表达阳性. 着色面积(1/3为(+), 1/3 -2/3为(++), )2/3为(+++). 40 ml/L戊二醛固定后的肝组织, 经锇酸后固定, 包埋后, 制成70 nm厚超薄切片, 铅铀双染色后, 透射电镜检查.

统计学处理 计量资料以mean±SD表示. 统计分析采用SAS软件包进行, 组间比较采用方差分析, 计数资料采用x2检验.

2 结果

氧化苦参碱预防各剂量组未见腹水发生, 死亡情况分别为: 低剂量组1只, 中剂量组3只, 高剂量组2只, 预防对照组7只. 大鼠CCl4注射后短期出现兴奋症状, 表现为活动增加, 奔跑等, 而后为抑制症状, 表现为活动减少、团缩, 全身被毛稀疏无光泽. 从症状程度来看, 预防组明显轻于对照组. 预防对照组大鼠体质量获得较氧化苦参碱预防低、中和高剂量组显著降低(P<0.05或P<0.01). 肝质量/体质量比值显著升高, 而氧化苦参碱预防组显著降低(P<0.01), 并随氧化苦参碱剂量增大有降低趋势(表1).

表1 各组动物的一般情况.
组分n体质量增加值(g)肝质量/体质量肝纤维化分期
S0S1S2S3S4
正常对照20230±150.033±0.00120
预防对照2378±26b0.048±0.002a002714
预防低剂量29133±18a0.039±0.002b026147
预防中剂量27156±27b0.038±0.002b041094
预防高剂量28151±29b0.037±0.001b151282
aP<0.05,
bP<0.01, vs 预防组.
2.1 组织学检查

氧化苦参碱预防组较对照组肝纤维化程度显著改善, 氧化苦参碱中、高剂量组肝纤维化程度轻于氧化苦参碱低剂量组. 氧化苦参碱正常对照组肝脏无明显改变. 氧化苦参碱预防组肝纤维化程度较对照组明显减轻(P<0.01), 中和高剂量组略好于低剂量组(P>0.05).

免疫组织化学检查氧化苦参碱对照组I, III, IV型胶原表达均显著增加, 明显高于氧化苦参碱预防各剂量组(P<0.01)(表2). 预防对照组I型胶原主要分布在纤维隔, III和IV型胶原在Disse间隙也非常明显, 形成肝窦基底膜, 显示典型的肝窦毛细血管化. III和IV型胶原在预防低剂量组大鼠肝窦内沉积较少, 未见典型的肝窦毛细血管化形成. 中、高剂量组I、III和IV型胶原沉积显著低于低剂量组(图1, 图2). 电镜下见氧化苦参碱预防对照组肝细胞胞质疏松, 并有胶原纤维形成, 肝血窦纤维化及闭塞, 血窦壁下可见基底膜样物质, 而氧化苦参碱预防组病变程度较对照组显著减轻(图3, 图4).

图1
图1 对照组肝脏I型胶原免疫组化染色×200.
表2 氧化苦参碱对I, III和IV型胶原表达的影响.
组分nI
II
III
-++++++-++++++-++++++
对照组23025160051801616
低剂量29261381418637145
中剂量271814431011338115
高剂量2821013331294211123
图2
图2 氧化苦参碱中剂量组肝组织I型胶原免疫组化染色×200.
图3
图3 对照组肝细胞胞质疏松, 并有胶原纤维形成 EM×8000.
图4
图4 氧化苦参碱中剂量组肝细胞胞质疏松, 无胶原纤维形成EM×21000.
3 讨论

苦参类生物碱有抗肝纤维化作用[1-5], 在抗肝损伤方面具有良好的药理活性日益引起人们对苦参类生物碱的重视和兴趣. 肝纤维化是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)在肝内大量沉积造成的, 他是各种慢性肝损伤向肝硬化发展的必经阶段, 一旦发生很难逆转, 现阶段对肝纤维化的防治尚缺乏有效措施, 如何寻找有效的抗肝纤维化药物已成为目前亟待解决的问题[16-21]. ECM的沉积增加及降解减少是肝纤维化形成的基础, 肝内ECM成分主要包括以下三类: 胶原、非胶原性糖蛋白及蛋白多糖, 而胶原是最主要的成分. 在肝脏内发现的胶原至少有近十种, 其中以I、III型为主, 约各占正常肝脏胶原的40%和50%. I型和III型胶原主要分布于肝包膜、汇管区、血管壁. 肝纤维化时, 胶原含量增加47倍, 早期以III型胶原为主, 晚期则以I型为主; IV型胶原为基底膜胶原, 过多沉积引起肝窦毛细血管化, 影响肝内外物质交换, 加重肝功能损害[22-25]. 本文组织学检查结果发现对照组肝脏炎症和纤维化程度明显高于氧化苦参碱预防组, 免疫组织化学检测显示预防对照组大鼠肝内有大量I、III和IV型胶原沉积, 其中III型和IV型胶原的沉积形成肝窦毛细血管化, 而氧化苦参碱预防组肝内胶原沉积较少, 无明显的肝窦毛细血管化形成; 此外, 电镜学检查显示氧化苦参碱预防组肝细胞损伤程度亦较对照组显著减轻. 这些结果说明口服氧化苦参碱可减少CCl4诱导的大鼠肝纤维化组织中胶原纤维的表达, 同时有保护肝细胞的作用, 对肝纤维化的发生有预防作用. 肝星状细胞是肝纤维化发生的主要效应细胞, 其激活和增生是肝纤维化发生的基础, 因此抑制肝星状细胞的活化和增生是治疗肝纤维化的方向[17,18,21,26-32]. 我们既往的研究亦证明了氧化苦参碱可抑制肝星状细胞的增生及产生ECM的作用, 在临床上有研究报道氧化苦参碱可用于治疗慢性病毒性肝炎肝纤维化[1,2], 组织病理学也证明其有减轻肝纤维化的作用, 已应用于临床. 尽管目前有不少报道氧化苦参碱有抗肝纤维化作用, 但其确切机制尚待进一步研究.

1.  陆 伦根, 曾 民德, 茅 益民, 李 继强, 万 谟彬, 李 成忠, 陈 成伟, 傅 青春, 王 吉耀, 佘 为民. 氧化苦参碱胶囊治疗慢性乙型病毒性肝炎的随机、双盲、安慰剂对照多中心临床研究(I). 肝脏. 2002;7:218-221.  [PubMed]  [DOI]
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