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世界华人消化杂志. 2003-01-15; 11(1): 100-102
在线出版日期: 2003-01-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i1.100
自身CD3AK细胞过继免疫治疗乙型肝炎47例
刘军权, 陈复兴, 金义生, 陈子鉴, 张春平, 俞谨, 周忠海
刘军权, 陈复兴, 周忠海, 中国人民解放军第97医院实验科 江苏省徐州市 221004
金义生, 陈子鉴, 张春平, 俞谨, 中国人民解放军第97医院传染科 江苏省徐州市 221004
通讯作者: 刘军权, 221004, 江苏省徐州市铜山路226号, 中国人民解放军97医院实验科. lxuming@pub.xz.jsinfo.net
收稿日期: 2002-01-11
修回日期: 2002-01-15
接受日期: 2002-01-17
在线出版日期: 2003-01-15

目的: CD3AK(Anti-CD3 antibody induced activated killer, CD3AK)细胞具有增生快、杀瘤活性强和杀瘤谱广的特点. 本文旨在评估用CD3AK细胞过继回输治疗乙型肝炎的疗效.

方法: 用淋巴细胞分离液分离乙型肝炎患者末梢血单个核细胞, 然后将末梢血单个核细胞加入含有IFN-a、IL-2和CD3单抗的培养基中进行培养扩增, 将经培养后的CD3AK细胞回输给患者; 患者一个疗程接受CD3AK细胞总数在(0.8-7.0)×1010.

结果: 在47例接受治疗者中, 治疗结束后HBeAg+HBV-DNA转阴率为53.2%. 总有效率(HBeAg和/或HBV-DNA转阴)为74.5%. CD3和CD8T淋巴细胞绝对值在CD3AK细胞治疗后均增加在85%以上.

结论: 用自身CD3AK细胞过继回输治疗能明显提高乙型肝炎患者细胞免疫功能, 治疗结束后HBeAg+HBV-DNA转阴率达53.2%.且无毒副作用, 对乙型肝炎是一种安全有效的治疗方法.

关键词: N/A
引文著录: 刘军权, 陈复兴, 金义生, 陈子鉴, 张春平, 俞谨, 周忠海. 自身CD3AK细胞过继免疫治疗乙型肝炎47例. 世界华人消化杂志 2003; 11(1): 100-102
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: January 11, 2002
Revised: January 15, 2002
Accepted: January 17, 2002
Published online: January 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

随着分子生物学与细胞免疫学的发展和对乙型肝炎的发病机制的研究表明.生物治疗正成为治疗乙型肝炎的一种重要手段.在生物治疗中, 细胞过继免疫治疗是临床应用较多的一种治疗方法, 其治疗效果的关键, 是输注细胞的数量和质量.因而探寻在体外培养出大量高质量的抗病毒效应细胞一直是大家所关注的问题. 为此我们采用患者自身外周血单个核细胞(PBMC)经体外用鼠抗人CD3单克隆抗体和白介素2等细胞因子联合诱导, 回输治疗47例乙型肝炎病毒(HBV)感染患者.现将治疗结果报告如下.

1 材料和方法
1.1 材料

47例为本院1997-01/2000-01住院与门诊患者, 按1995年全国病毒性肝炎诊断标准, 其中慢性乙型肝炎33例, 乙型肝炎病毒携带者14例.男37例, 女10例, 年龄14-50岁.47例中44例 HBeAg及 HBV-DNA均阳性, 3例仅 HBV-DNA阳性; 1年内均未行抗病毒治疗. 试剂: 鼠抗人CD3单克隆抗体(CD3mAb)购自北京邦定生物公司; 人重组白介素2(rhIL-2)由南京军事医学科学研究所提供; 人重组a-干扰素(rhIFN-α)购自上海生物制品研究所; RPMI1640完全培养液(包括RPMI 1640和10%胎牛血清), 购自Gibico公司; T淋巴细胞亚群试剂盒, 购自武汉生物制品研究所.

1.2 方法

(1)CD3AK细胞诱导方法: 抽患者外周血200 mL, 先离心分离出血浆备用, 再吸出富含白细胞层的细胞约10 mL, 悬浮于等量患者自身血浆中, 用淋巴细胞分离液分离, 收集单个核细胞.剩余红细胞用生理盐水补充至原体积后回输给患者.单个核细胞用无菌生理盐水洗涤3次, 将细胞按2×109·L-1数量悬浮于RPMI-1640完全培养基中, 加入经抗CD3mAb包被的6孔细胞培养板, 每孔6 mL, 加入终含量为5×104 u·L-1 rhIL-2和1×106u·L-1 rhIFN-α 37 ℃, 50 mL·L-1 CO2条件下培养, 每2 d半量换培养基1次, 并调整细胞密度至2×109/L.培养7 d后, 经细菌和霉菌培养阴性后再收集细胞, 用无菌生理盐水洗3次, 将细胞悬浮于自身血浆中, 加入5×104 u rhIL-2, 用输血器回输给患者, 2 h内输完.(2) CD3AK细胞表型测定: 用流式细胞仪(美国B.D公司的FACSCaliur, 分析软件为Simul SET)测定和分析, 每次获取15 000个细胞, 用H.PYLORI彩色打印机打印结果.(3)T细胞亚群和T细胞亚群绝对值测定: 患者在CD3AK细胞治疗前后用法国Hemacell plus全自动血细胞分析仪做全血细胞记数.同时测定患者外周血T淋巴细胞亚群, 并将各亚群百分数乘以淋巴细胞总数即得T细胞亚群绝对值.(4)疗效判断: 显效: HBeAg与HBV-DNA均转阴; 有效: HBeAg与HBV DNA有一项转阴; 无效: HBeAg与HBV DNA无变化.有肝功能异常者先给予常规护肝药物治疗, 待肝功能正常后, 回输CD3AK细胞; 肝功能正常者仅行回输治疗.回输前常规应用地塞米松2.5 mg, 2次/wk,(8-12)次为1疗程.回输细胞总数为(0.8-7)×1010.治疗前后行T细胞亚群和绝对值测定.治疗前后及随访时检查HBV-DNA、HBeAg和肝功能.

统计学处理 实验结果以mean±SD表示.用t检验比较各组间均数差异的显著性.

2 结果
2.1 CD3AK细胞表型

正常成人PBMC在培养前细胞的CD25和CD95的测定结果为9.09%和35.35%.而培养7 d时则为86.65%和66.64%.

2.2 乙型肝炎患者经CD3AK细胞治疗前后T细胞亚群及其绝对值测定结果

47例患者有41例检测了T细胞亚群和绝对值.经CD3AK细胞治疗后, CD3、CD8T细胞百分率及其绝对值比治疗前显著增高, CD4T细胞百分率及其绝对值也比治疗前明显增高.结果见表1.

表1 经CD3AK细胞治疗前后T细胞亚群及其绝对值变化(mean±SD).
分组n治疗前治疗后
CD3T细胞410.57±0.050.83±0.11b
CD3T细胞绝对值411539.7±216.72905.7±335.3b
CD4T细胞410.33±0.030.38±0.06a
CD4T细胞绝对值41989.6±151.31330.3±176.6a
CD8T细胞410.27±0.060.47±0.13b
CD8T细胞绝对值41729.7±121.41645.7±110.3b
aP<0.05 vs 治疗前;
bP<0.01 vs 治疗前.
2.3 治疗后血清中HBeAg和HBV-DNA转阴情况

治疗前44例HBeAg阳性者, 治疗后有29例HBeAg(65.9%)转阴. 47例HBV-DNA阳性者治疗后有31例转阴, 转阴率为66.0%. 按疗效判断标准, 显效53.2%(25/47), 有效21.3%(10/47), 无效25.5%(12/47), 总有效率为74.5%.

2.4 随访结果

经3 mo-2年随访, HBeAg转阴者由治疗结束时的25例增至29例, 转阴率为65.9%(29/44), HBV-DNA转阴者由15例增至31例, 转阴率为66.0%(31/47). 有2例患者治疗结束时HBeAg与HBV-DNA仍为阳性, 随访期间曾出现低度ALT增高, 未作治疗, 经休息自行复常, 且HBeAg和HBV DNA转阴, 表明本疗法具有治疗后效应.

2.5 副作用

47例总计回输489次.仅有6例次于回输结束后30 min出现体温37.8-38.5 ℃的发热.未经处理, 约2 h后体温自行恢复正常.全部患者血尿常规均无明显变化.

3 讨论

CD3AK细胞是一种较新型的肿瘤效应细胞, 已用于治疗各种恶性肿瘤[1], 但用于慢性乙型肝炎临床治疗的报告较少. 由于病毒和癌基因产物的抗原提呈大都属内源性抗原提呈途径, 因此人们尝试用LAK细胞治疗病毒性疾病. 其治疗效果令人鼓舞[2-7]. 我们的疗效比单用IL-2和LAK细胞治疗的效果好.

CD3AK细胞治疗乙型肝炎病毒感染的确切机制尚不清楚, 可能与以下机制有关. (1)CD3AK细胞是异质性细胞群, 末梢血单个核细胞中的CD8+ 和部分CD4+T细胞以及少量其他细胞随着在体外培养时间的延长, 这些细胞比例在不断的改变, 尤其是CD8＋T细胞增高最为明显. 由于乙型肝炎病毒感染者体内可存在乙肝病毒特异性T细胞, 而这些细胞主要为CD8＋T细胞. 因此, 从患者血中分离出的这种淋巴细胞在体外被扩增后激活, 回输体内即可杀伤被乙型肝炎病毒感染的靶细胞[8]. 我们的研究结果表明, 正常成人PBMC经培养后CD95＋、CD25＋CD45RO细胞明显增加[9] ; 大多数患者经过一个疗程治疗后, 血中CD3＋、CD8+T细胞百分数及其绝对值显著增加. (2) CD3AK细胞可分泌IFN-a、IL-2和TNF等细胞因子, 已知这些细胞因子能抑制病毒的复制[10-17] . (3)由于肝炎患者的肝细胞既表达Fas又表达Fasl. 而CD3AK细胞也可以表达Fas与Fasl [18]. 许多实验结果表明, 肝炎患者T细胞上Fas分子在用CD3mAb激活后明显增加, 回输的CD3AK细胞可以较好地作用于乙型肝炎病毒感染的肝细胞, 使其发生凋亡[19,20]. (4)我们的实验表明, 乙型肝炎感染患者的淋巴细胞在用CD3mAb激活后, 淋巴细胞CD25比激活前明显增加, 回输后的T细胞可以在体内增生, 本法治疗后效应可能与此有关.

本文有部分患者一个疗程后未能达到治疗效果, 可能与以下因素有关. (1)回输的CD3AK细胞数量不够;(2)CD3AK细胞质量上存在一些问题. 在培养中发现, 这些患者用CD3mAb激活后细胞增生缓慢, CD25表达增加不明显. 当然还可能与病毒变异、某些细胞黏附分子如MHC-I类分子和ICAM-I表达缺陷有关[21].

有关过继性免疫治疗尚无统一方案. 我们认为回输细胞总数应大于1×1010可能才能具有治疗作用. 将CD3AK细胞回输治疗与其他药物应用相结合, 适当调整CD3AK细胞亚群的比例, 增加细胞和某种细胞因子(如干扰素、IL-2) [22,23]用量及某些药物如拉米夫定等联合应用可能会取得更好效果.

编辑: N/A

1.  赵 志泉, 沈 斌, 吕 秀珍, 徐 顺福, 孙 宏训. CD3AK细胞体外对SMMC-7721人肝癌细胞株杀伤作用的实验研究. 中华消化杂志. 1997;17:239-240.  [PubMed]  [DOI]
2.  周 岳进, 许 雪延, 胡 素琴, 胡 操寒, 孔 晓彩, 金 伟虎, 池 月志. 基因工程干扰素α-2b加CD3AK治疗慢性乙型肝炎. 临床肝胆病杂志. 1997;13:198-200.  [PubMed]  [DOI]
3.  董 寒梅, 张 瑞阳. 自体与异体LAK细胞治疗慢性肝炎130例. 新消化杂志. 1997;5:313-314.  [PubMed]  [DOI]
4.  方 蕾, 陈 复兴. 抗原的加工和提呈. 国外医学分子生物学分册. 1994;16:231-234.  [PubMed]  [DOI]
5.  张 言超, 吴 文漪, 陈 明, 韩 方正. 慢性中重型肝炎自体LAK细胞回输治疗效果的细胞免疫分析. 华人消化杂志. 1998;6:826-827.  [PubMed]  [DOI]
6.  张 树林, 刘 敏, 朱 江, 柴 宁莉. Th2优势应答与HBV慢性感染. 世界华人消化杂志. 1999;7:513-515.  [PubMed]  [DOI]
7.  Penna A, Del Prete G, Cavalli A, Bertoletti A, D'Elios MM, Sorrentino R, D'Amato M, Boni C, Pilli M, Fiaccadori F. Predominant T-helper 1 cytokine profile of hepatitis B virus nucleocapsid-specific T cells in acute self-limited hepatitis B. Hepatology. 1997;25:1022-1027.  [PubMed]  [DOI]
8.  Riddell SR, Greenberg PD. Principles for adoptive T cell therapy of human viral diseases. Annu Rev Immunol. 1995;13:545-586.  [PubMed]  [DOI]
9.  陈 复兴, 刘 军权, 王 涛, 黄 健, 骆 晓梅. 人PBMC经数种活化剂活化后的表型变化. 中国肿瘤生物治疗杂志. 1999;6:186-187.  [PubMed]  [DOI]
10.  Riddell SR, Greenberg PD. Therapeutic reconstitution of human viral immunity by adoptive transfer of cytotoxic T lymphocyte clones. Curr Top Microbiol Immunol. 1994;189:9-34.  [PubMed]  [DOI]
11.  蒋 道荣, 姚 登福, 孟 宪镛. 乙型肝炎患者外周血T细胞亚群和可溶性IL-2R的研究. 新消化病学杂志. 1997;5:98-99.  [PubMed]  [DOI]
12.  南 月敏, 王 麟士, 吴 文娟, 谢 永富, 庞 英. 乙型肝炎及原发性肝癌患者sIL-2R的变化. 新消化病学杂志. 1997;5:319-320.  [PubMed]  [DOI]
13.  靖 大道, 邱 德凯. 乙型肝硬变患者外周血IL-2, IL-2R与肝功能的关系. 华人消化杂志. 1998;6:900-901.  [PubMed]  [DOI]
14.  王 九平, 李 新红, 朱 勇, 王 爱莲, 连 建奇, 贾 战生, 谢 玉梅. 慢性乙型肝炎患者T细胞亚群, mIL-2R, sIL-2R, IL-6, IL-8, TNF-α变化及意义. 世界华人消化杂志. 2000;8:763-766.  [PubMed]  [DOI]
15.  刘 军权, 陈 复兴, 陈 子鉴, 王 涛, 张 春平. IL-2不同注射途径对慢性乙型肝炎患者T细胞功能的影响. 世界华人消化杂志. 2001;9:352-353.  [PubMed]  [DOI]
16.  游 晶, 庄 林, 唐 宝璋, 杨 惠, 杨 微波, 李 武, 张 宏丽, 张 艳梅, 张 禄, 严 绍明. 干扰素联合胸腺肽治疗慢性乙型肝炎. 世界华人消化杂志. 2001;9:388-391.  [PubMed]  [DOI]
17.  Wang J, Hargrove ME, Ting CC. IL-2 and IL-4 mediate through two distinct kinase pathways for the activation of alphaCD3-induced activated killer cells. Cell Immunol. 1996;174:138-146.  [PubMed]  [DOI]
18.  施 广霞, 程 一櫂, 钱 振超. 抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱导的PBL增生与凋亡共存现象的研究. 中国免疫学杂志. 1995;44:6.  [PubMed]  [DOI]
19.  郎 振为, 王 海舰, 孟 忻, 李 俊强, 张 士杰. 乙型肝炎患者肝组织中Fas配体的表达. 中华内科杂志. 1997;36:655-657.  [PubMed]  [DOI]
20.  甘 华山, 陈 友琴. 细胞凋亡与病毒性肝炎. 世界华人消化杂志. 2001;9:579-581.  [PubMed]  [DOI]
21.  陈 复兴, 武 建国. 病毒性疾病的T细胞免疫治疗. 国外医学病毒学分册. 1997;20:46-43.  [PubMed]  [DOI]
22.  杜 清友, 王 福生, 徐 东平, 刘 洪, 雷 周云, 刘 明旭, 王 业东, 陈 菊梅, 吴 祖泽. 新型免疫活性细胞CIK体外对肝癌细胞的杀伤. 世界华人消化杂志. 2000;8:863-866.  [PubMed]  [DOI]
23.  Ting CC, Hargrove ME. Anti-CD3 antibody-induced activated killer cells: cytokines as the additional signals for activation of killer cells in effector phase to mediate slow lysis. Cell Immunol. 1991;135:273-284.  [PubMed]  [DOI]