乙型肝炎病毒慢性感染者血清中不同类型病毒转录体的检测及其意义

图1 HBx DNA和RNA扩增引物的位置. 数字表示Xho I酶切坐标, 括号内数字表示扩增产物的大小.

图2 HBx 转录体 RT-PCR的特异性, 与其C区和S区RT-PCR反应结果的对照及其3'端结构. 15例HCC患者血清(A-Q), 9例HBsAg(HBs) 阳性, 6例阴性(底部I), P和Q为各种反应的对照. 应用其核酸提取物分别进行HBx区DNA PCR(系列A), 全长型(fRNA; 系列G)和顿挫型病毒转录体(trRNA; 系列H)半巢式锚定RT-PCR反应; 相同的标本经DNase I消化后检测病毒DNA HBx区(系列B), 病毒转录体 HBx区(系列C和D), C区(系列E)和S区(系列F). 系列A, PCR检测病毒DNA, 引物对txs3/xas1, 产物长度为235 bp, 采用DNase I消化过的来自1例(trRNA) 阳性HCC组织的RNA提取物(P)和trRNA cDNA质粒pMT9T41A(Q) 作为对照, 溴化乙锭(EB)染色显示. 系列B, 半巢式PCR检测病毒DNA, 外引物对为txs3/xas1, 内引物对为tx1/xas1, 产物长度为215 bp, 对照同系列A. 系列C和D, 逆转录反应后进行-轮(系列C, 引物txs3/xas1, 长度235 bp)或两轮PCR(系列D, 引物对为txs3/xas1和tx1/xas1, 长度为215 bp) 检测病毒转录体HBx区段, 对照同于系列A, 分别经EB染色(上)或应用P32-ATP标记的寡核苷酸探针(1561+)进行Southern杂交(下)显示扩增产物. 系列E和F, 逆转录反应后进行两轮PCR检测病毒转录体C区段(系列E, 引物对为couts/coutas和cins/cinas, 产物长度为172 bp)和S区段(系列F, 引物对为souts/soutas和sins/sinas, 长度为143 bp), P为trRNA cDNA质粒pMT9T41A, Q分别为C区cDNA质粒pd4(系列E)和来自1例阳性肝硬变组织[14]的RNA提取物(系列F), EB染色显示. 系列G和H, 逆转录反应后进行两轮锚定PCR检测病毒转录体3'端结构fRNA(系列G, 产物长度为370 bp)和trRNA(系列H, 长度为245 bp), 分别经EB染色或Southern杂交显示扩增产物(详见图1). 每个凝胶的左侧以bp 数显示DNA标准物.

图3 血清中HBx区核酸检测的代表性数据. 扩增产物分别经溴化乙锭染色(Eb)或Southern杂交(Hyb)显示, HBx区DNA(DNA)和转录体(RNA), 全长型(fRNA)和顿挫型病毒转录体(trRNA)以及GAPDH RNA(GAPDH)分别为235, 370, 245和305 bp. 底部显示相应的血清学指标, 包括HBsAg(HBs)及其抗体(Anti-HBs), HBeAg(HBe)及其抗体(Anti-HBe),和HBcAg抗体(Anti-HBc).

图4 HCV阳性HCC患者血清中的HBV核酸. 顶部大写字母表示不同患者的血清标本(A-I)和对照, 后者包括水(J), fRNA的cDNA pMT9T40A(K)和trRNA的cDNA pMT9T41A(L). 相应的血清学数据见底部.

图5 fRNA RT-PCR中由锚定引物造成的不对称扩增. 来自15例HBsAg阳性的HCC患者血清核酸提取物(A-O)与图2相同, 用水作为阴性对照(P), 质粒DNA pMT9T40A为阳性对照(Q). 在溴化乙锭染色的凝胶上, 扩增产物为两条带, 一条位于预期的370 bp, 另一条在接近300 bp的位置(Eb). 用两个相同的凝胶分别进行Southern印迹, 制备两个相同的印迹膜, 一个与P32-ATP标记的反意寡核苷酸探针(1 590-)杂交检测＋股产物, 另一个与P32-ATP标记的正意寡核苷酸探针(1 561+)杂交, 检测-股产物.

图6 血清中病毒核酸水平及组成与HBeAg和HBsAg转阴的关系. HBsAg阳性组在HBeAg转阴前(s+/e+)和转阴后(s+/e-)以及HBsAg阴性但病毒核酸阳性组(s-/na+)的血清标本中病毒DNA(Viral DNA; A), 全长型(fRNA; B)和顿挫型病毒转录体(trRNA; C)表现不同. D为两种根据上述两种RNA分子的相对比例确定的５种不同的病毒转录体组合类型(f/trRNA patterns): fRNA-/trRNA-(-/-); trRNA单独型(tr2 ); trRNA为主型(tr1); 较低水平fRNA为主型(f2)和高水平fRNA为主型(f1). A: γ = 0.58, P<0.05, 95 % CI = 0.51-0.64; B: γ = 0.60, P<0.05, 95 % CI = 0.53-0.67; (C): γ = 0.008, P<0.05, 95%CI = -0.12-0.11; (D): γ = 0.51, P<0.05,95%CI = 0.42-0.60. 底部括号内为每组病例数.

图7 血清中病毒核酸水平与谷-丙转氨酶值(ALT values)的关系. A. Viral DNA:γ = 0.39, P<0.05, 95%CI = 0.24-0.55.B. fRNA:γ = 0.28, P<0.05, 95%CI = 0.11-0.46.C. trRNA:γ = 0.04, P>0.05, 95%CI = -0.20-0.13.ALT值(I U/L): 0-40, 正常范围; 41-80, 轻度升高; >80, 显著升高. 底部括号内为每组病例数.

图8 不同年龄组血清中病毒核酸水平(A-C)以及两种RNA分子的相对比例(D). A. Viral DNA: g = 0.31, P<0.05, 95%CI = 0.17-0.44.B. fRNA:γ = 0.32, P<0.05, 95%CI = 0.20-0.45.C. trRNA:γ = 0.07, P>0.05, 95%CI = -0.07-0.22.D. f/trRNA patterns:γ = 0.31, P<0.05, 95%CI = 0.18-0.43.底部括号内为每组病例数.

图9 HBV感染分期示意图. A: 由产生病毒颗粒的细胞进展为停止包装病毒颗粒但产生trRNA和未包被衣壳的病毒DNA的细胞; B: 感染晚期表现为非复制状态, 无(上)或有(下) trRNA表达.