修回日期: 2020-06-11
接受日期: 2020-06-18
在线出版日期: 2020-08-08
肝细胞移植(hepatocyte transplantation, HCT)是治疗肝衰竭非常有前景的手段, 虽然很多因素影响其有效性, 但受体的免疫排斥反应是影响HCT疗效的主要因素, 为了减少其排异反应, 临床不得不应用大量的免疫抑制剂而增加其风险; 有实验证实紫外线可引起免疫抑制, 不过紫外线也能导致细胞DNA损伤, 那么如何寻求一种平衡, 既能降低肝细胞免疫原性, 又能避免紫外线对肝细胞的过度损伤, 从而较好保存肝细胞的稳定性和细胞合成功能. 所以寻找适合的紫外线照射强度或许可以达到这样的效果.
本研究的主题就是通过不同的实验证实适合的紫外线强度既能引起相应的免疫抑制, 又不至于引起肝细胞的稳定性的破坏而影响细胞功能. 拟解决的问题是原代肝细胞的经紫外线照射对细胞活力、线粒体膜、蛋白合成功能和引起淋巴细胞增殖活性的影响. 这些问题的解决对HCT的临床应用有较好的促进作用.
通过实验确定适合的紫外线照射强度, 在这一强度下可以抑制肝细胞的免疫反应, 且实验肝细胞的生物学活性不受或较少受影响. 实现这一目标可以提高移植细胞的存活效率, 减少或避免免疫抑制剂的应用.
本研究取外科手术切除的良性病变肝组织, 经改良的胶原酶灌注法分离得到成人原代肝细胞, 分为对照组(0 J/m2)和四个不同强度紫外线照射组(分别为200、350、550和750 J/m2), 台盘蓝拒染和CCK-8法检测肝细胞的活力; JC-1检测线粒体膜电位的变化, 通过荧光显微镜可以观察膜电位变化导致的细胞凋亡, 并通过酶标仪读取OD值进一步量化膜损伤程度; 直接混合淋巴细胞肝细胞培养(mixed lymphocyte hepatocyte culture, MLHC)检测紫外线对肝细胞的引起淋巴细胞增殖的效率, 全自动生化分析仪检测肝细胞的白蛋白的合成功能. 从不同角度检测紫外线对肝细胞的影响.
本研究基本达到实验目的, 首先成功分离来源于成人良性病变手术切除肝组织的肝细胞, 胎盘蓝拒染活率在90%以上, 在200 J/m2紫外线强度照射组, CCK-8检测肝细胞的活率和形态学上与对照组无差异; JC-1法无论从荧光显微镜下观察所见还是酶标仪量化计算结果都展示了较好的线粒体膜稳定性; 生化结果也证实了在这一强度下肝细胞有较好的白蛋白合成功能; MLHC实验也表现出了肝细胞引起淋巴细胞增殖抑制现象, 且有统计学意义. 而增大照射强度则肝细胞则显示肝细胞的活力衰退、膜电位下降, 细胞凋亡, 从而细胞的蛋白合成能力减弱, 并且发现肝细胞引起淋巴细胞增殖能力加强, 这可能与因肝细胞受损表达了肝细胞相表观藏的抗原有关.
发现低剂量的紫外线照射可降低肝细胞引起淋巴细胞增殖活性; 同时还能较好的保存肝细胞的活力、线粒体膜电位的稳定性, 从而保证了细胞功能的正常发挥, 通过本研究也证实了适当的紫外线照射可引起免疫抑制现象. 这些发现或许对HCT的临床实践有一定的应用价值.
本研究的教训是做增殖实验只用了经典的MLHC实验检验肝细胞引起淋巴细胞增殖活力下降, 而应该选用更多的方法证实这一现象, 比如EdU实验检测细胞增殖过程中的DNA来进一步说明其增殖效应. 未来的研究方向是探索更好的肝细胞培养技术减少和组长肝细胞凋亡, 并一步研究紫外线对肝细胞表观生物学性状的影响, 说明其导致免疫抑制的机制.