修回日期: 2010-01-25
接受日期: 2010-02-01
在线出版日期: 2010-03-18
目的: 探讨生长抑素类似物奥曲肽(OCT)联合细胞毒化疗药物丝裂霉素(MMC)对胃癌细胞系SGC-7901的抑制作用.
方法: 体外培养人胃癌细胞株SGC-7901, 分别设空白组、对照组、OCT组、MMC组以及OCT+MMC组. 用MTT比色法观察对胃癌细胞生长的影响; 用免疫组织化学法分析对细胞凋亡调节基因Bcl-2表达的影响.
结果: 在OCT组中, 当浓度从1×10-9 g/L到1×10-3 g/L变化时, OCT对胃癌细胞均有抑制, 当OCT为1×10-5 g/L时, 其抑制作用最明显(20.9%, P<0.05). MMC随着浓度由1×10-4 g/L增加至1×10-2 g/L其抑制率也由14.1%增加至71.1%, 呈递增趋势. OCT联合MMC的抑制作用随着MMC浓度由1×10-3 g/L增加至5×10-3 g/L, 抑制率也由22%增加至45.8%(均P<0.05); 当MMC为5×10-3 g/L时, 联合治疗组优于单独给药组(54.8% vs 30.4%, P<0.05). OCT、MMC及OCT+MMC均可以下调Bcl-2的表达, 阳性细胞数分别为12.9%、6.7%和5.0%(均P<0.05), 其中OCT+MMC组下调作用最明显.
结论: OCT联合MMC可以增强对胃癌细胞的抑制作用, 联合应用可以减低MMC的剂量.
引文著录: 苏海燕, 刘文天, 王邦茂, 张文治, 苏心. 生长抑素类似物联合丝裂霉素对胃癌细胞的抑制作用. 世界华人消化杂志 2010; 18(8): 815-818
Revised: January 25, 2010
Accepted: February 1, 2010
Published online: March 18, 2010
AIM: To investigate the synergistic effects of somatostatin analogue octreotide (OCT) and chemotherapeutic drug mitomycin (MMC) on the growth of gastric cancer SGC-7901 cells.
METHODS: SGC-7901 cells were cultured in vitro and divided into four groups: control group, OCT group, MMC group and OCT plus MMC group. The proliferation of SGC-7901 cells was evaluated by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. The expression of apoptosis-related protein Bcl-2 was measured by immunohistochemistry.
RESULTS: OCT at concentrations ranging from 1 × 10-9 g/L to 1 × 10-3 g/L could exert inhibitory effects on the growth of SGC-7901 cells. OCT at a concentration of 1 × 10-5 g/L achieved a reduced rate of cell proliferation of 20.9%, significantly higher than that in the control group (P < 0.05). The reduced rates of cell proliferation varied from 14.1% to 71.1% when the concentrations of MMC increased from 1 × 10-4 g/L to 1 × 10-2 g/L. OCT in combination with MMC showed a synergistic effect on the growth of SGC-7901 cells: the reduced rates of cell proliferation varied from 22% to 45.8% when the concentration of MMC increased from 1 × 10-3 g/L to 5 × 10-3 g/L (P < 0.05). The combined inhibitory effects of MMC and OCT were higher than that of MMC (5 × 10-3 g/L) alone (54.8% vs 30.4%, P < 0.05). The percentages of Bcl-2-positive cells were reduced in the OCT group, MMC group and OCT plus MMC group (12.9%, 6.7% and 5.0%, respectively). The percentage of Bcl-2-positive cells was significantly lower in the OCT plus MMC group than in the OCT group and MMC group (both P < 0.05).
CONCLUSION: OCT can enhance the inhibitory effects of MMC on the growth of SGC-7901 cells.
- Citation: Su HY, Liu WT, Wang BM, Zhang WZ, Su X. Octreotide enhances the inhibitory effects of mitomycin on the growth of gastric cancer SGC-7901 cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2010; 18(8): 815-818
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v18/i8/815.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v18.i8.815
胃癌是消化系常见恶性肿瘤之一, 其发病率占所有恶性肿瘤的第1位, 近年我国胃癌死亡率呈上升趋势[1]. 手术是治疗胃癌的主要方法, 但其恶性程度高、转移早及多药耐药等问题常导致进展期胃癌术后复发和转移、远期疗效不理想, 因此化疗仍占有重要地位. 近年来, 生长抑素类似物(somatostatin analogue, SSTA)的抗肿瘤活性备受关注, 本文将着重研究OCT对胃癌细胞的抑制作用以及联合MMC的抗肿瘤效果.
人胃癌细胞株SGC-7901, 由本实验室提供. 标准胎牛血清(FBS)购自美国HycLone公司. 四甲基偶氮唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司. 胰蛋白酶购自美国Gibco公司. 丝裂霉素(MMC)购自协和发酵工业株式会社. SSTA-奥曲肽(OCT)由瑞士诺华公司提供.
1.2.1 细胞培养: 人胃癌细胞株SGC-7901培养于含100 g/L热灭活FBS的RPMI 1640培养基中, 在37 ℃、50 mL/L CO2及饱和湿度培养箱中培养.
1.2.2 MTT实验: 取对数生长期的人胃癌细胞株SGC-7901, 调整细胞浓度为1×104/mL, 接种于96孔培养板中, 每孔100 μL, 同时进行以下实验: (1)空白组, 不含细胞; (2)对照组, 含细胞不加药物; (3)OCT组, 每孔中加入OCT后其终浓度分别为1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9 g/L; (4)MMC组, 每孔中加入MMC后其终浓度分别为: 1×10-4、1×10-3、2.5×10-3、5×10-3、7.5×10-3、1×10-2 g/L; (5)OCT(1×10-5 g/L)+MMC组: MMC取小于IC50的3个浓度1×10-3、2.5×10-3和5×10-3 g/L. 每个浓度设8个平行复孔, 培养24 h后加入MTT(5 g/L)每孔15 μL, 再培养4 h, 弃去上清液, 每孔加入DMSO 150 μL, 震荡至MTT完全溶解, 酶联检测仪600 nm处测吸光度(A)值, 求抑制率. 抑制率 = (对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%.
1.2.3 免疫组织化学法测定Bcl-2蛋白在胃癌细胞的表达: 将实验分为对照组、OCT组(1×10-5 g/L)、MMC组(5×10-3g/L)和OCT+MMC组, 37 ℃, 50 mL/L CO2孵育箱中培育24 h后, PBS冲洗, 固定, 室温孵育, 血清封闭, 加鼠抗人P53单克隆抗体4 ℃过夜, 次日加入山羊抗小鼠IgG, 滴加SABC, 加入DAB-H2O2显色, 显微镜观察. 在Olympus倒置光学显微镜下Bcl-2阳性细胞呈棕黄或棕黑色, 与背景同色为阴性. 而后200倍显微镜下计数5个视野, 计算阳性细胞百分数.
统计学处理 实验数据均由3次以上独立的重复实验得出, 计量资料以mean±SD描述, 数据统计用SAS统计软件进行t检验、组间资料的方差分析及χ2检验, P<0.05具有统计学意义.
随着OCT浓度由1×10-9 g/L增加至1×10-5 g/L, 其抑制率由7.9%增加至20.9%, 再增加浓度至1×10-3 g/L其抑制率转而下降为14.3%. 当OCT为1×10-5 g/L时, 其A值与对照组相比有统计学差异(P<0.05).
随着MMC浓度由1×10-4 g/L增加至1×10-2 g/L其抑制率也由14.1%增加至71.1%, 呈递增趋势. 当MMC浓度为1×10-4 g/L时, 其A值与对照组相比无统计学差异(P>0.05), 余治疗组与对照组相比均有统计学差异(均P<0.05).
随着MMC浓度由1×10-3 g/L增加至5×10-3 g/L, MMC+OCT的抑制率也由22%增加至45.8%. 各治疗组与对照组相比均有统计学差异(均P<0.05).
当MMC为1×10-3 g/L时, OCT、MMC及OCT+MMC三者的抑制率之间无统计学差异(P>0.05); 当MMC为2.5×10-3 g/L时, OCT与MMC及MMC与OCT+MMC之间无统计学差异(P>0.05), 但OCT与OCT+MMC之间有统计学差异(P<0.05); 当MMC为5×10-3 g/L时, OCT与MMC之间无统计学差异(P>0.05), OCT+MMC与OCT及OCT+MMC与MMC之间均有统计学差异(均P<0.05, 图1).
OCT、MMC及OCT+MMC均可以下调Bcl-2的表达, MMC及OCT+MMC与对照组相比有统计学差异(P<0.05), 其中OCT+MMC组下调作用最明显(图2).
生长抑素(somatostatin, SST)是一种下丘脑及胃肠道D细胞分泌的神经肽类激素, 具有抑制脑垂体生长激素分泌、调节胃肠激素分泌、消化系外分泌以及胃肠内脏血流的作用. 天然SST的血浆半衰期较短(不超过3 min), 临床开发出几种SSTA, 其血浆半衰期约为120 min, 而且抑制生长激素从垂体释放的作用较SST强约50倍. 目前, SSTA已用于许多临床疾病的治疗, 例如: 垂体瘤、肝硬化食管静脉曲张出血以及急性胰腺炎等, 并取得良好疗效. 由于SST具有诱导癌细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长等作用, 应用SSTA治疗肿瘤, 特别是胃肠道肿瘤已成为一个研究热点[2,3]. OCT是目前临床中常用的SSTA.
生长抑素受体(somatostatin receptor, SSTR)在体内不仅存在于正常组织中, 多种肿瘤也表达SSTR, 这是应用SSTA治疗肿瘤的分子基础[4,5]. 大量研究显示[6-8], SSTA抗肿瘤机制包括(1)与存在于肿瘤细胞表面的SSTR结合后发挥的直接作用; (2)与存在于正常细胞表面的SSTR结合的间接作用. Denzler等报道, 在1例胃癌患者的肿瘤周围黏膜下层血管有成倍的SSTR表达, 而在来自食管或胰腺癌而没有胃部病变的对照组胃黏膜下层血管中SSTR表达就很少[9]. SSTR亚型的研究显示, 胃癌细胞膜上有SSTR3蛋白表达[10]. 还有研究显示胃癌肿瘤组织中存在5种SSTR亚型的表达, 并以SSTR2表达最为显著[11]. 胃癌细胞系SGC-7901是人低分化胃腺癌细胞, 细胞膜表达SSTR2、3[12,13]. 因此, 这为OCT治疗胃癌提供了可能. 间接的抗肿瘤作用是通过抑制GH/IGF-1轴, 从而抑制促肿瘤生长的细胞因子或激素(EGF、胰岛素、IGF-1、CCK等)的合成与分泌、抑制肿瘤血管的形成、诱导肿瘤细胞发生凋亡. Ferjoux等[14]认为受体亚型不同, SSTA抗增殖作用就会涉及不同的传导通路.
本研究显示, 单独应用OCT作用于胃癌细胞系SGC-7901, 随着浓度的增加其抑制率也增加, 但当其浓度达到1×10-5 g/L时, 其抑制率最大为20.9%, 再增加浓度其抑制率反而下降, 提示OCT对SGC-7901的抑制具有饱和性, 这也间接提示了SGC-7901表面存在与OCT结合的SSTR.
当OCT与MMC联合应用时, 其抑制率与两药单独应用相比有所增加. 随着MMC浓度由1×10-3 g/L增加至5×10-3 g/L时, 其抑制率由16.6%增加至30.4%, 联合OCT(1×10-5 g/L)后其抑制率由22.0%增至45.8%. 由实验结果可见, 1×10-5 g/L OCT及低浓度的MMC对SGC-7901的抑制无明显差异, 但当二者联合应用时, 轻度MMC浓度的增加, 可以导致对SGC-7901的明显抑制. 该结果显示, OCT可以增强 MMC对胃癌细胞的抑制作用, 联合应用可以使小剂量的MMC抑制作用增加, 因而减少MMC的不良反应.
Bcl-2是目前公认的调节细胞凋亡的重要基因之一, 其激活和过度表达能抑制细胞正常的凋亡, 延长细胞寿命, 使生理状态下细胞凋亡和增殖的动态平衡发生紊乱, 从而增加肿瘤发生的机会并促进肿瘤的发展. 有研究证实Bcl-2基因在胃癌中呈高表达[15,16]. 本研究结果显示, OCT可以下调Bcl-2的表达, 这可能是OCT抑制胃癌细胞生长的机制之一. OCT联合MMC后, 使其阳性细胞指数由6.7%下降至5.0%. 由此可见, OCT可协同MMC下调Bcl-2的表达, 减少Bcl-2对细胞凋亡的抑制, 进而达到抑制胃癌细胞生长的作用.
OCT是自身分泌的神经肽类激素, 有较低的毒性, 同时又具有一定的抗肿瘤特性; 细胞毒化疗药物具有抑制肿瘤细胞生长的作用, 但其存在抑制效率低、不良反应多的缺陷, 二者的联合应用则有可能增强作用效率、减少用药剂量, 从而减少不良反应, 本研究的结果初步显示了OCT与MMC联合应用的优势.
胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤, 发病率、死亡率高, 手术和化疗是主要治疗手段. 但是由于恶性程度高、转移早以及术后复发和转移等, 远期疗效不理想. 化疗药物不良反应大, 患者耐受性差, 因此本课题组希望找到一种不良反应小、具有抗肿瘤活性的药物, 能够增强化疗药的作用.
宋于刚, 教授, 南方医科大学南方医院消化内科研究所
生长抑素类似物-奥曲肽(OCT)对胃癌抑制作用和机制的研究已有报道, 但是单独应用抑制率不高, 效果不明显. 因此本研究应用OCT联合丝裂霉素(MMC), 结果显示联合应用抑制率高于MMC单独用药, 其机制可能是通过下调细胞凋亡抑制基因Bcl-2的表达, 今后仍需要进一步的进行动物实验, 以明确其临床价值.
OCT具有抗肿瘤活性, 但其自身的抑癌活性较弱, 单独用药尚不能达到满意的疗效, 因此本课题组研究OCT联合经典的化疗药物MMC的作用, 探讨OCT是否具有化疗药增敏剂的作用, 并进一步从细胞凋亡调节基因Bcl-2表达上探讨了二者联合的机制和可能.
本研究从细胞水平探讨了OCT联合MMC对胃癌细胞的抑制作用, 为今后进一步的临床试验提供了细胞水平的应用基础.
本研究选题较好, 设计基本合理, 结果可靠, 学术价值较好.
编辑:李瑞敏 电编:何基才
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