胃癌相关基因GCRG213正反义真核表达载体的构建及鉴定

摘要

目的: 构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体.

方法: 从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段, 两端分别引入限制性内切酶KpnI, BamHI和EcoRI, BamHI识别位点, 按正向、反向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+). 测序正确的重组子pcDNA3.1-a(含GCRG213正向克隆), pcDNA3.1-b(含GCRG213反向克隆)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞, G418筛选获得稳定转染的细胞株, 采用半定量RT-PCR及Western blot比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异.

结果: 经测序证实, GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3.1(+), 组成重组子pcDNA3.1-a(含正向克隆), pcDNA3.1-b(含反向克隆). 重组子pcDNA3.1-a, pcDNA3.1-b和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞, G418筛选获得稳定转染的细胞株. 与对应的空载体比较, RT-PCR结果显示转染pcDNA3.1-a的MKN45细胞中其mRNA的表达上调35.4%, 而转染pcDNA3.1-b的MKN45细胞中其mRNA的表达下调32.1%; Western blot结果显示转染pcDNA3.1-a的MKN45细胞中其蛋白的表达上调49.4%, 而转染pcDNA3.1-b的MKN45细胞中其蛋白的表达下调50.3%.

结论: 成功构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体.

关键词: 胃癌相关基因GCRG213; 真核表达; 胃癌细胞; 基因转染

Construction and identification of eukaryotic expression vector of gastric cancer associated gene GCRG213

Li-Li Gao, Ben-Yan Wu, Meng-Wei Wang, Hai-Li Huang, Yin-Qiao Wu, Wei-Di You, Wei-Hua Wang

Li-Li Gao, Ben-Yan Wu, Meng-Wei Wang, Hai-Li Huang, Yin-Qiao Wu, Wei-Di You, Wei-Hua Wang, Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China

Supported by: National Science Foundation of China, No. 30370635.

Correspondence to: Dr. Wu-Ben Yan, Department of Gastroenterology, South Building, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China

Received: February 13, 2006
Revised: March 16, 2006
Accepted: March 20, 2006
Published online: May 28, 2006

Abstract

AIM: To construct and identify the gastric cancer associated gene GCRG213 eukaryotic expression vector.

METHODS: The sense and anti-sense fragment of GCRG213 were obtained by polymerase chain reaction (PCR), which were GCRG213-a and GCRG213-b respectively. They were cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) after introduced the sites of restrictive endonuclease enzyme KpnI, BamHI and EcoRI, BamHI. The recombinant plasmid pcDNA3.1-a, pcDNA3.1-b and the vector pcDNA3.1 were transfected separately into MKN45 cells conducted by lipofectamine^TM 2000. G418 selection was used to obtain the stably transfected cells. The expression of GCRG213 was detected at both mRNA and protein level with semi-quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR) and Western blot, respectively.

RESULTS: After sequencing, sense GCRG213 and anti-sense GCRG213 were confirmed to be successfully cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1, which were named pcDNA3.1-a and pcDNA3.1-b correspondingly. The recombinant plasmid pcDNA3.1-a, pcDNA3.1-b, and the vector pcDNA3.1 were transfected successfully into MKN45 cells by lipofectamine^TM 2000. After G418 selection, the stably transfected cells were obtained. Transfection with pcDNA3.1-a significantly increased the expression of GCRG213 in MKN45 cells both at mRNA (35.4%) and protein (49.4%) level, while transfection of pcDNA3.1-b significantly decreased the expression of GCRG213 both at mRNA (32.1%) and protein (50.3%) level.

CONCLUSION: The eukaryotic expression vector of gastric cancer associated gene GCRG213 is successfully constructed and identified.

Key Words: Gastric cancer associated gene GCRG213; Eukaryotic expression; Gastric cancer cells; Gene transfection

0 引言

胃癌是严重威胁人类健康的重要疾患之一, 其发生和发展是多基因变异累积的过程. 我们应用荧光标记的DDRT-PCR筛选出一条在肠型胃癌组织、癌旁和正常组织间差异表达的新基因GCRG213, 生物信息学分析表明他具有完整的开放阅读框架, 编码含有142个氨基酸的产物. 原位杂交和Northern blot显示该基因在胃癌和癌旁不典型增生组织高表达, 正常胃组织低表达. 制备多克隆抗体初步检测表明该基因在胃癌、癌旁、正常组织中有蛋白水平的表达差异. 经过同源比对, 该基因与机体中碱基切除修复的关键酶APE/Ref-1序列有61%, 同源性并且含有其保守区的功能位点[1].

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonucleas, APE)是一种具有DNA修复与氧化还原双功能的蛋白, 人体APE由Ref-1基因编码, APE/Ref-1是碱基切除修复(base excision repair, BER)通路的关键酶, 能够修复机体受内外环境影响产生的AP位点[2]. APE的氧化还原功能可调节许多转录因子DNA结合活性, 与细胞的增殖、分化、损伤修复有关[3]. 近年来研究发现Ref-1基因是一种肿瘤相关基因. 由于GCRG213与APE/Ref-1有同源性, 并且具有该蛋白重要的功能位点, 因此可能是其一个新的变异体. 该变异体在胃癌和癌前不典型增生组织中mRNA和蛋白水平表达高于正常胃黏膜, 说明他参与了胃癌的发生、发展过程, 可能是影响胃癌细胞生物学特性的重要功能基因.

我们采用分子克隆及基因转染技术将GCRG213基因转入哺乳动物细胞, 以期望能对GCRG213基因的功能有一初步了解.

1 材料和方法

1.1 材料

pGEM-T质粒含GCRG213 cDNA 1094 bp, 其中开放阅读框架426 bp, 为本实验室构建保存. MKN45细胞为本实验室保存, 在37 ℃, 50 mL/L CO₂的孵箱中常规培养. 限制性内切酶(KpnⅠ, BamHⅠ, EcoRⅠ)和T4连接酶购自日本宝生物(TaKaRa)工程有限公司. 真核表达载体pcDNA3.1(+)为本实验室保存. 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、高纯度质粒小量提取试剂盒、总RNA提取试剂盒和DH5α感受态细胞购自北京天为时代科技有限公司. 脂质体(Lipofectamine^TM 2000)购自美国Gibco公司. G418购自美国Sigma公司. DMEM培养基、RT-PCR试剂盒为美国Gibco公司产品. 胎牛血清购自北京鼎国生物工程公司. 羊抗人β-actinmAb、HRP标记的羊抗兔二抗、HRP标记的兔抗羊二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司. 兔抗人GCRG213多克隆抗体为本实验室保存. 低分子质量蛋白质标准购自北京天为时代科技有限公司. 预染蛋白分子量标准购自New England 公司. ECL Western blot检测试剂盒购自美国Santa Cruz公司. 其余试剂均为国产或进口分析纯试剂.

1.2 方法

采用Primer 5.0软件设计引物, 选取了GCRG213序列中包含有开放阅读框架(ORF)的序列作为扩增序列, 根据真核表达载体pcDNA3.1(+)的要求, 引物序列如下: 正向克隆(a)引物P1: 5'-GGGGTACCATGCAACAAGAAGAGCTA-3', P2: 5'-CGGGATCCTCAGTTTTGAGTGAGCTTC-3'; 反向克隆(b)引物P1: 5'-AAGAATTCATGCAACAAGAAGAGCTA-3', P2: 5'-CGGGATCCTCAGTTTTGAGTGAGCTTC-3'(产物预计长度445 bp), 由上海博亚生物工程公司合成. PCR扩增靶DNA片段, 反应条件为: 94 ℃ 2 min. 94 ℃ 30 s, 51 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 32个循环. 72 ℃延伸7 min. 采用清华大学天为时代科技公司PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化回收. 取纯化DNA 5 µL, 以10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析. 纯化后DNA需要经紫外分光光度计检测样品的A₂₆₀和A₂₈₀, 以确定样品DNA的含量. PCR纯化产物经KpnⅠ, BamHⅠ和EcoRⅠ, BamHⅠ分别双酶切后, 琼脂糖凝胶电泳回收纯化. 真核表达载体pcDNA3.1(+)同样经KpnⅠ, BamHⅠ和EcoRⅠ, BamHⅠ分别双酶切后回收纯化. GCRG213的酶切纯化产物与真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切纯化产物按3:1的比例混合, 加入T4连接酶进行连接反应(16 ℃过夜), 重组子(pcDNA3.1-a, pcDNA3.1-b)转化DH5α感受态细胞, 涂布具有氨苄青霉素(100 mg/L)的LB琼脂平板, 于37 ℃培养过夜. 挑取单个菌落以PCR、内切酶切割、测序依次鉴定之. 使用Lipofectamine^TM2000脂质体转染试剂并按其说明书方法进行. 将MKN45细胞接种于6孔板, 待细胞数量达到90%-95%汇合后进行瞬时转染, 每孔分别加入10 µL Lipofectamine^TM2000转染试剂和对应质粒, 在50 mL/L CO₂培养箱中37 ℃保温24 h, 将细胞按1:10的稀释比例传代至含100 mL/L FBS的DMEM培养基中, 再培养1 d后换用含G418(500 mg/L)的完全培养基常规培养, 每3-4 d更换培养液, 每日观察细胞生长情况, 抗性细胞集落形成后, 用含半量筛选浓度G418(250 mg/L)的完全培养基扩大培养. 在此后的实验过程中, 间断地取出部分细胞在含500 mg/L的G418的条件培养基中筛选, 未能稳定转染的细胞在6-8 d全部死亡, 转基因MKN45细胞却能持续存活并生长传代.

1.2.1 半定量RT-PCR检测转染细胞中GCRG213 mRNA的表达: 采用总RNA提取试剂盒, 按操作说明提取转染细胞的总RNA. 紫外检测仪分别在260 nm和280 nm波长下检测RNA的吸光度值, 测定RNA的纯度, 并用甲醛变性电泳实验检测RNA的完整性. 取RNA 4 µg进行逆转录, 然后各自取cDNA 1 µL用于PCR反应. GCRG213基因引物序列如下: P1: 5'-AACTGCAGATGCAACAAGAA-3', P2: 5'-CGGGATCCAAGTTTTGAGTGAG-3'; 以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照, 引物序列如下: P1: 5'-GCTCCGGCATGTGCAAGG-3', P2: 5'-ATGTCACGCACGCTTTCC-3'. PCR引物由上海博亚生物工程公司合成. 反应条件: 94 ℃ 2 min. 94 ℃ 30 s, 51 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30个循环. 72 ℃延伸7 min. 取反应液5 mL, 以10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析. 产物电泳后经凝胶分析软件(Bandscan)分析其灰度值, 结果以产物与内参照的比值表示.

1.2.2 Western blot检测转染细胞GCRG213蛋白的表达: SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳, 按照《分子克隆实验指南》灌制120 g/L的不连续SDS-PAGE, 分别取3组转染细胞裂解液样品(每个均取细胞蛋白100 mg)加样后电泳, 湿式电转移, 封闭, 第1抗体结合, 第2抗体结合, ECL法显影. 以β-actin为内参照. 经凝胶分析软件(Bandscan)分析其灰度值, 结果以产物与内参照的比值表示.

统计学处理 成组t检验(SPSS 11.0软件包).

2 结果

GCRG213正向、反向克隆的PCR产物(a, b)经10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 可见在445 bp处各有一条特异的扩增产物, 与预计长度相符(图1). 真核表达载体pcDNA3.1(+)载体分别应用限制性内切酶KpnⅠ, BamHⅠ和EcoRⅠ, BamHⅠ双酶切, 产物经10 g/L低熔点琼脂糖凝胶纯化、回收, 在5400 bp处有一特异条带, 与理论值相符(图2). pcDNA3.1-a, pcDNA3.1-b重组质粒经相应的引物PCR扩增后, 经10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 可见在445 bp处各有一条特异的扩增产物, 与预计长度相符. pcDNA3.1-a, pcDNA3.1-b重组质粒分别经限制性内切酶KpnⅠ, BamHⅠ和EcoRⅠ, BamHⅠ双酶切, 产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 分别在5400 bp处和445 bp处有一特异条带, 与理论值相符(图3-4).

图1 GCRG213基因PCR扩增纯化回收. M: DNA Marker DL2000; 1: GCRG213-a; 2: GCRG213-b.

图2 pcDNA3. 1载体双酶切、纯化回收. M: DL15000 Marker; 1, 2: pcDNA3.1载体; 3, 4: pcDNA3.1载体双酶切产物.

图3 pcDNA3. 1-a, pcDNA3.1-b重组质粒PCR鉴定. M: DL2000 Marker; 1: pcDNA3.1-a PCR鉴定产物; 2: pcDNA3.1-b PCR鉴定产物.

图4 pcDNA3. 1-a, pcDNA3.1-b重组质粒酶切鉴定. M: DL15000 Marker; 1: pcDNA3.1-a重组质粒; 2: pcDNA3.1-b重组质粒; 3: pcDNA3.1-a重组质粒酶切产物; 4: pcDNA3.1-b重组质粒酶切产物.

2.1 转染细胞GCRG213在mRNA水平上的表达

RT-PCR法检测结果表明, 与转染空载体的MKN45细胞相比, 转染GCRG213正向克隆的MKN45细胞中其mRNA的表达上调35.4%, 而转染反向克隆的MKN45细胞中其mRNA的表达下调32.1%. MKN45-213a, MKN45-213b, MKN45-pcDNA3.1 mRNA表达量分别为0.328±0.05, 0.144±0.013, 0.212±0.016(图5).

图5 3种稳定转染细胞GCRG213在mRNA水平上的表达差异. 1: pcDNA3.1-a转染组; 2: pcDNA3.1-b转染组; 3:pcDNA3.1转染组; M: DNA Marker Ⅲ.

2.2 转染细胞中GCRG213蛋白水平上的表达

Western blot检测结果表明, 与转染空载体的MKN45细胞相比, 转染GCRG213正向克隆的MKN45细胞中其蛋白的表达上调49.4%, 而转染反向克隆的MKN45细胞中其蛋白的表达下调50.3%. MKN45-213a, MKN45-213b, MKN45-pcDNA3.1蛋白表达量分别为3.42±0.05, 0.861±0.013, 1.732±0.016(图6).

图6 3种稳定转染细胞GCRG213蛋白及内参照β-actin的表达差异. 1: pcDNA3.1-a转染组; 2: pcDNA3.1-b转染组; 3: pcDNA3.1转染组.

3 讨论

我们采用真核表达载体pcDNA3.1作为胃癌相关基因GCRG213转染的载体, GCRG213基因正向克隆和反向克隆插入到pcDNA3.1的KpnⅠ, BamHⅠ和EcoRⅠ, BamH酶切位点之间, 构建了GCRG213的正义和反义真核表达载体. 我们提取3种稳定转染的MKN45细胞总RNA, 采用RT-PCR方法观察不同转染细胞中GCRG213 mRNA水平的表达差异. 与转染空载体的MKN45细胞相比, 转染GCRG213正向克隆的MKN45细胞中其mRNA的表达上调35.4%, 而转染反向克隆的MKN45细胞中其mRNA的表达下调32.1%, 以上结果提示, 正向克隆的转染增加了相应基因的转录, 而反向克隆的转染则抑制了相应基因的转录.

Western blot首先提取转染细胞的蛋白质, 通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 将提取的蛋白质浓缩并由于凝胶的分子筛作用和带负电的SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中向正极迁移, 分离不同大小分子质量的蛋白质, 再转移至固相支持体, 通过蛋白特异性的多克隆抗体, 检测转染细胞GCRG213蛋白的表达. 蛋白质的Western blot技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异性、敏感性, 可检测到低至1-5 ng中等大小的蛋白质[4]. 本实验中, Western blot结果为: 与转染空载体的MKN45细胞相比, 转染GCRG213正向克隆的MKN45细胞中其蛋白的表达上调49.4%, 而转染反向克隆的MKN45细胞中其蛋白的表达下调50.3%, 以上结果提示, 正向克隆的转染增加了GCRG213蛋白的表达, 而反向克隆转染则抑制了GCRG213蛋白的表达.

BLAST分析显示GCRG213与APE/Ref-1序列有61%同源性, 并且含有其C'末端保守区[1]. APE/Ref-1主要参与由于氧化性损伤造成的DNA损害的修复; 同时, APE/Ref-1也是一种氧化还原因子, 调节转录因子的DNA结合活性. DNA修复机制异常是癌症进展过程中常见的现象. 人体APE由Ref-1基因编码, 编码的蛋白命名为APE/Ref-1或者HAP1. Ref-1基因是一种肿瘤相关基因. Ref-1对一种苯衍生的DNA复合物1, N6-benzetheno-dA(p-BQ-dA)具有序列依赖性, 提示Ref-1在苯诱导的致癌过程中发挥作用[5]. Herring et al[6]研究了人宫颈癌促克隆形成细胞与APE/Ref-1蛋白表达的关系, 发现肿瘤活检组织的促克隆形成细胞与APE/Ref-1蛋白表达之间存在中等程度的显著正相关(r = 0.60, P = 0.002). APE/Ref-1能激活一些氧化的原癌基因, 在卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、横纹肌肉瘤、生殖细胞肿瘤等多种肿瘤中APE/Ref-1表达增强[7]. 我们成功构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体, 为下一步研究胃癌相关基因GCRG213的功能奠定了基础.

评论

背景资料

胃癌是严重威胁人类健康的重要疾患之一, 其发生和发展是多基因变异累积的过程. 近年来研究发现Ref-1基因是一种肿瘤相关基因. 由于GCRG213与APE/Ref-1有同源性, 并且具有该蛋白重要的功能位点, 因此可能是其一个新的变异体. 本文采用分子克隆及基因转染技术将GCRG213基因转入哺乳动物细胞, 成功构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体, 为下一步研究胃癌相关基因GCRG213的功能奠定了基础.

同行评价

本研究构建了胃癌相关基因GCRG213的正、反义真核表达载体, 建立了稳定转染的MKN45细胞株, 并采用半定量RT-PCR及Western blot比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异. 研究设计合理, 方法可行, 结果充实, 结论较为明确, 为下一步研究胃癌相关基因GCRG213的功能奠定了一定基础.

备注

电编:张敏 编辑:潘伯荣

参考文献

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Kakolyris S, Kaklamanis L, Giatromanolaki A, Koukourakis M, Hickson ID, Barzilay G, Turley H, Leek RD, Kanavaros P, Georgoulias V. Expression and subcellular localization of human AP endonuclease 1 (HAP1/Ref-1) protein: a basis for its role in human disease. Histopathology. 1998;33:561-569.  [PubMed]  [DOI]

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