研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2006-01-08; 14(1): 92-95
在线出版日期: 2006-01-08. doi: 10.11569/wcjd.v14.i1.92
幽门螺杆菌VacA重组蛋白对SGC7901胃癌细胞的作用
段秀杰, 邵世和, 闻平, 王文凯
段秀杰, 闻平, 江苏大学附属医院检验科 江苏省镇江市 212001
邵世和, 江苏大学医学技术学院微生物教研室 江苏省镇江市 212001
王文凯, 北华大学研究生部 吉林省吉林市 132001
基金项目: 江苏省科技厅资助项目, No. BS2004021; 江苏大学高级人才资助项目, No. JDG2004008.
通讯作者: 邵世和, 212001, 江苏省镇江市, 江苏大学医学技术学院微生物教研室. ljxwl123@163.com
电话: 0511-2165735
收稿日期: 2005-10-22
修回日期: 2005-10-25
接受日期: 2005-10-31
在线出版日期: 2006-01-08

目的: 研究幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)编码基因在大肠杆菌中的表达产物对SGC7901胃癌细胞的作用.

方法: 常规培养pET32a-vacA-E.coli BL21(DE3)工程菌株, IPTG诱导重组蛋白表达, 产物纯化后作用于胃癌细胞, 倒置显微镜及电镜等检测细胞生长情况.

结果: 重组蛋白作用于胃癌细胞后, 倒置显微镜下观察, 细胞生长受抑制, 其细胞空泡毒作用减弱甚至消失, 电镜下可见10%-20%左右细胞呈现轻度空泡变, 仅少数细胞空泡变明显, 细胞表面微绒毛消失, 少量细胞体积减小, 并出现了早期核着边固缩等凋亡改变.

结论: 重组VacA蛋白对胃癌细胞的生长具有抑制作用, 空泡毒作用减弱.

关键词: 幽门螺杆菌; 空泡毒素; 重组蛋白; 胃癌细胞
引文著录: 段秀杰, 邵世和, 闻平, 王文凯. 幽门螺杆菌VacA重组蛋白对SGC7901胃癌细胞的作用. 世界华人消化杂志 2006; 14(1): 92-95
Effect of recombinant VacA protein of Helicobacter pylori on gastric cancer cell line SGC7901
Xiu-Jie Duan, Shi-He Shao, Ping Wen, Wen-Kai Wang
Xiu-Jie Duan, Ping Wen, Department of Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
Shi-He Shao, Department of Microbiology, Medical Technology College of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
Wen-Kai Wang, Department of the Postgraduate, Beihua University, Jilin 132001, Jilin Province, China
Supported by: the Project from Department of Science and Technology of Jiangsu Province, No. BS2004021, and the Fund for Senior Talent of Jiangsu University, No. JDG2004008.
Correspondence to: Shi-He Shao, Department of Microbiology, Medical Technology College of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China. ljxwl123@163.com
Received: October 22, 2005
Revised: October 25, 2005
Accepted: October 31, 2005
Published online: January 8, 2006

AIM: To explore the effect of the recombinant protein expressed by Helicobacter pylori (H. pylori) VacA gene in E.coli on the gastric cancer cell line SGC7901.

METHODS: The engineered bacteria pET32a-VacA-E.coli BL21 (DE3) was cultured and analyzed. The isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was used to induce the expression of the recombinant protein. Then the purified protein was added into the gastric cancer cells, and the growth and morphological changes of the cell were observed by the inverted microscope and electron microscope.

RESULTS: The proliferation of the gastric cancer cells was inhibited after the recombinant protein was added. The effect of VacA was reduced or even failed. About 10%-20% SGC cells were lightly vacuolated, and only a few of them were severely vacuolated. The microvilli on the cell surface disappeared, and the volume of some cells was decreased. Apoptosis was induced by the recombinant VacA in some SGC cells.

CONCLUSION: The recombinant protein can inhibit the proliferation of gastric cancer cell, and the vacuolated effect becomes weakened and even fails.

Key Words: Helicobacter pylori; Vacuolate cytotoxin; Recombinant protein; Gastric cancer cell
0 引言

幽门螺杆菌是上消化道疾病的主要致病菌, 它的感染不但与胃炎、胃溃疡及非溃疡性消化不良有关, 而且与MALT淋巴瘤和胃癌也有重要关系[1-4], 己被世界卫生组织列为胃癌等肿瘤发生的相关致病菌[5]. H. pylori人群感染率在50%以上, 感染呈全球性分布, 其分泌的空泡毒素(VacA)在H. pylori致病过程中起重要作用, 因其能使细胞发生空泡变性而得名. 空泡毒素基因在大肠杆菌中克隆及表达己获成功, 但表达产物对SGC7901胃癌细胞的作用国内末见报道. 我们旨在研究表达产物对胃癌细胞的作用, 来探讨该融合蛋白的作用特性.

1 材料和方法
1.1 材料

pET32a-vacA-E.coli BL21(DE3)工程菌株由浙江大学微生物教研室严杰教授惠赠; SGC7901胃癌细胞购自吉林省肿瘤研究所; H. pyloriNCTC11637标准菌株购自中国预防医学科学院流病研究所; 6XHis标记蛋白纯化试剂盒Ni-TEDTM购自Active Motif公司; RPMI1640培养粉购自Life Technologies公司. CO2培养箱为美国FORMA公司产品; 电子显微镜为吉林大学基础医学院电镜室提供.

1.2 方法

1.2.1 重组蛋白表达及纯化: 挑选含重组载体的单个菌落接种于盛有LB选择性培养基的5支试管中37 ℃培养至A600nm = 0.4-0.6时, 加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG[6], 诱导pET32a-vacA-E.coli BL21(DE3)表达VacA, 4 h后离心收集菌体, 采用NTA亲和层析法原理用Ni-TEDTM试剂盒进行纯化.

1.2.2 H. pylori提取VacA与重组VacA对SGC7901胃癌细胞作用比较:H. pylori培养液中提取及纯化VacA常规培养H. pylori标准菌株, 培养滤液经半饱和硫酸铵沉淀后, 过SephadexG200柱, 收集具有VacA活性的色谱峰, PEG浓缩及微孔滤膜抽滤纯化.

1.2.3 二种VacA对SGC7901细胞作用比较: 将纯化的二种VacA经0.22 μm滤膜抽滤后, 平行加入培养至对数生长期的SGC7901胃癌细胞中(细胞密度为3X104/瓶), 37 ℃ CO2培养箱内培养, 倒置显微镜下连续观察细胞生长状态.

1.2.4 电镜观察重组蛋白对SGC7901作用: 将50、100、200、400 μL重组VacA分别加至4瓶培养至对数生长期的SGC7901细胞中(细胞密度为3X104/瓶), 培养2 d及3 d后用胰酶消化制成单个细胞悬液, 样本按常规方法制作病理切片, 电镜检测.

2 结果
2.1 重组VacA与H. pylori提取VacA对SGC790胃癌细胞作用比较

重组VacA作用于胃癌细胞1 d后, 倒置显微镜下观察, 细胞状态无明显改变(图1A), 2 d后细胞分裂明显慢于正常对照组, 3 d后部分细胞开始脱离瓶壁, 与阴性对照比较, 细胞总数减少, 细胞形态不典型, 但未出现明显空泡变. 而由H. pylori培养液提取并纯化的VacA作用于胃癌细胞后1 d, 细胞开始出现镜下可见小空泡, 以后空泡逐渐变大, 融合成大空泡, 3 d后部分细胞溶解死亡(图1BC).

图1
图1 重组VacA与从H. pylori提取VacA对SGC7901胃癌细胞作用 (×40). A: 正常对照SGC7901细胞; B: 重组VacA作用2 d SGC7901细胞; C: H. pylori提取VacA作用2 d SGC7901细胞.
2.2 电镜结果

结果表明, 重组VacA作用于SGC7901细胞后, 10%-20%细胞胞质仅出现轻度的空泡样变性, 3 d后少量细胞空泡毒作用稍明显, 可见到少量胞核内染色质趋边凝聚凋亡细胞(图2).

图2
图2 重组VacA作用于SGC7901细胞电镜分析 (×40). A: 阴性对照SGC7901细胞; B: 重组VacA作用3 d SGC7901细胞.
3 讨论

自从1982年Marshall和Warren从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜中分离出H. pylori以来, H. pylori与胃肠道疾病和肠道外疾病之间的关系受到广泛关注[7-9]. VacA是H. pylori重要致病因子之一, Supajatura et al[10]研究表明, 当H. pylori侵入机体引起胃黏膜内大量肥大细胞聚集, VacA可直接结合并激活肥大细胞, 使其释放大量炎性因子如TNF-a, IL, 巨噬细胞炎性蛋白等, 为进一步诱发胃炎甚至胃癌成为可能. 在体外, 仅有50%-60% H. pylori能产生具有活性的VacA[11], 他能黏附于靶细胞, 并被靶细胞吞噬, 在细胞内表达而产生空泡作用, 也有研究认为VacA可能是通过作用于细胞膜上的Na+-K+-ATP酶, 影响离子间转运而引起细胞空泡样变性. 有文献报道, VacA毒素能够抑制表皮生长因子与其受体的结合, 从而引起酪氨酸磷酸化, 扰乱了上皮细胞的信号传导, 导致上皮损害. Yuan et al[12]研究表明, VacA能引起线粒体去极化, 从而引起胃上皮细胞凋亡, 影响或干扰细胞骨架各成份引起肌动蛋白重排, 甚至使微管结构发生紊乱. 本研究表明, 从H. pylori提取的VacA能使细胞发生空泡变, 而重组VacA空泡毒作用减弱甚至消失, 这与国外的一些研究结果相吻和. Manetti et al[13]也是利用E.coli表达重组VacA蛋白, 但未能成功诱导HeLa细胞空泡化, 其原因可能是由于重组蛋白在表达时, 晶体结构折叠不完全从而失去部分空泡毒活性. Kuck et al[14]利用在自然条件下表达并纯化的重组VacA作用于胃上皮细胞系AGS, 发现其可以诱导细胞凋亡, 但仍不能诱导空泡形成. Ye et al[15]用携带vacA基因的质粒转染HeLa细胞后发现, 在宿主细胞质内表达的VacA片段可诱导空泡形成, 克服了体外重组蛋白的缺陷. 我们认为, 重组VacA蛋白空泡毒作用强弱是否与所作用的不同细胞株特性有关尚有待进一步研究. 重组蛋白具有良好的抗原性, 因此可以设想利用重组蛋白制作疫苗来预防和清除H. pylori感染, 将是有效防治包括胃炎, 胃溃疡在内的上消化道疾病的希望所在. 本实验结果还表明, 重组VacA虽然诱导细胞空泡变性作用减弱甚至消失, 但可抑制癌细胞的生长. 重组蛋白可在大肠杆菌中得到高效表达而且纯化方便, 故为以后制作ELISA快速诊断试剂盒以及制备高效安全的疫苗奠定了基础.

评论
背景资料

幽门螺杆菌与胃炎、胃溃疡、MALT淋巴瘤和胃癌等上消化道疾病有重要关系, 己被世界卫生组织列为胃癌第一类致癌原. H. pylori感染呈全球性分布, 其分泌的空泡毒素是H. pylori主要致病毒素. 空泡毒素基因在大肠杆菌中克隆及表达己获成功, 但表达产物对SGC7901胃癌细胞的作用及其与H. pylori提取空泡毒素活性比较国内末见报道. 我们旨在研究表达产物对胃癌细胞的作用, 来探讨该融合蛋白的作用特性.

研发前沿

多年来幽门螺杆菌与各种胃部疾病的相关性以及幽门螺杆菌感染的根治一直是本研究领域的研究热点, 目前研究重点是找到合适的幽门螺杆菌蛋白抗原用以研制出特效的根除幽门螺杆菌感染的疫苗, 为人类的健康作贡献.

创新盘点

本文是在总结和应用国内外相关专家的相关研究基础上, 将幽门螺杆菌提取VacA和重组VacA蛋白活性加以比较, 更深入了解该重组蛋白的抗原特性, 为幽门螺杆菌疫苗的研制提供理论基础.

应用要点

通过研究表明,重组VacA蛋白对胃癌细胞的生长具有抑制作用，空泡毒作用减弱. 该重组VacA蛋白具有良好的抗原性,可以作为幽门螺杆菌疫苗研制候选蛋白之一.

电编:李琪 编辑:菅鑫妍 审读:张海宁

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