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世界华人消化杂志. 2005-01-15; 13(2): 207-210
在线出版日期: 2005-01-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i2.207
肿瘤坏死因子-α基因启动子区点突变与乙型肝炎相关
周越塑, 王福生, 刘明旭, 金磊, 洪卫国
周越塑, 王福生, 刘明旭, 金磊, 洪卫国, 中国人民解放军302医院传染病研究所生物工程室 北京市 100039
周越塑, 男, 1968-3-4生, 江苏丰县人, 汉族, 1992年第二军医大学毕业, 2002年军医进修学院硕士研究生毕业, 主治医师, 从事传染病临床工作.
基金项目: 北京市自然科学基金重点项目资助, No. 01Z094.
通讯作者: 王福生, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军302医院传染病研究所生物工程室. fswang@publicbta.net.cn
电话: 010-66933332 传真: 010-63831870
收稿日期: 2004-06-21
修回日期: 2004-11-07
接受日期: 2004-12-27
在线出版日期: 2005-01-15

目的: 调查我国汉族健康人群和乙肝患者中TNF-α基因启动子区点突变的分布特点, 并探讨HBV感染与TNF-α基因多态性之间的关系.

方法: 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)的方法对健康人群(103例)与HBV患者(232例)的TNF-α基因启动子区-308 G→A单碱基突变多态性进行了分析.

结果: TNF-α基因启动子区-308 G→A单碱基突变频率在HBV患者中的分布明显低于健康人群(4.7% vs 9.7%, P<0.05). 不同性别、不同HBV血清标记类型、不同HBV DNA肝炎患者之间TNF-α(-308 G→A)基因型与突变频率均无显著性差异.

结论: 我国汉族人群TNF-α的基因启动子区-308 nt单碱基多态性可能与HBV的发病及易感性相关.

关键词: HBV; TNF-α; 基因多态性
引文著录: 周越塑, 王福生, 刘明旭, 金磊, 洪卫国. 肿瘤坏死因子-α基因启动子区点突变与乙型肝炎相关. 世界华人消化杂志 2005; 13(2): 207-210
Relationship between susceptibility of hepatitis B virus and gene polymorphism of tumor necrosis factor-α
Yue-Su Zhou, Fu-Sheng Wang, Ming-Xu Liu, Lei Jin, Wei-Guo Hong
Yue-Su Zhou, Fu-Sheng Wang, Ming-Xu Liu, Lei Jin, Wei-Guo Hong, Department of Infectious diseases, Division of Bioengineering, 302 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100039, China.
Supported by: Natural Science Foundation of Beijing, No. 01Z094.
Correspondence to: Fu-Sheng Wang, Department of Infectious diseases, Division of Bioengineering, 302 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100039, China. fswang@public.bta.net.cn
Received: June 21, 2004
Revised: November 7, 2004
Accepted: December 27, 2004
Published online: January 15, 2005

AIM: To investigate the characteristics of point mutation distribution in TNF-α gene promoter region, and to explore the relationship between hepatitis B virus (HBV) infection and the polymorphism of TNF-α gene in Chinese Han Population.

METHODS: The single nucleotide polymorphism (SNP) in TNF-α gene promoter region (-308 G→A) was detected in 232 hepatitis B patients and 103 health controls using polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism assay (PCR- RFLP).

RESULTS: The frequency of SNP in TNF-α promoter region (-308 G→A) decreased significantly in hepatitis B patients, in comparison with that in controls (4.7% vs 9.7%, P < 0.05). The genotypes and SNP frequency showed no significant differences between males and females, among patients with different HBV markers and different HBV DNA.

CONCLUSION: TNF-α gene polymorphism may be related to the susceptibility to hepatitis B virus infection in Chinese Han population.

Key Words: HBV; TNF-α; Gene polymorphism
0 引言

HBV感染, 不同个体的差异可能与多种因素有关, 如病毒本身的因素、宿主免疫因素和遗传因素等[1]. 免疫应答有关的细胞因子基因的多态性可能对HBV感染的病程和结局产生一定的影响, 其中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)是重要的细胞因子之一[2-3]. TNF-α基因启动子区-308 nt(相对于转录起始点)存在一个多态性位点, 即在常见基因型中为G(-308G/G), 在少见基因型中被A取代(-308G/A或-308A/A), 该变异可能与TNF-α基因表达程度相关[4-6], 也与结核等传染病的易感性有关[7-9], 我们研究了该位点多态性在中国汉族HBV感染患者及健康人群中的分布情况, 探讨其与HBV感染及病程的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

我院住院血清HBV DNA PCR阳性患者232例, 其中男191例, 女41例, 年龄6-73(32±15)岁. 急性肝炎10例, 慢性肝炎(轻)70例, 慢性肝炎(中)53例, 慢性肝炎(重)23例, 肝炎肝硬化76例. 挑选我院健康体检人员中HBV表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体均为阴性者103例为对照组. 2组年龄相当、无自身免疫性疾病或其他慢性病. 所有患者及健康人均为汉族, 来自北京及周围省市.

1.2 方法

用QIAGEN公司的基因组DNA提取试剂盒, 自外周血200 μL中分离DNA作为PCR模板[10]. 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)检测: 扩增TNF-α启动子区域包含-308 nt的上、下游引物分别为5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3'(对应于-332 nt~-310 nt, 23 mer)及 5'-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3'(对应于-245~-226 nt, 20 mer), 扩增产物长度107 bp; PCR反应: 扩增体系为25 μL, 含4×2.5 mmd/L dNTP 1 μL, 12.5 μmd/L上、下游引物各1 μL, 10×PCR缓冲液 2.5 μL, 基因组DNA 100 ng, Taq DNA聚合酶0.5 U. PCR条件为94 ℃ 4 min变性, 然后再94 ℃ 1 min, 60 ℃ 50 s, 72 ℃ 1 min, 30个循环, 72 ℃ 10 min; 采用RFLP方法判断TNF-α多态性: 于8 μL扩增产物中加3 U内切酶Nco I, 37 ℃ 16 h后, 酶切产物以2.5 g/L琼脂糖凝胶电泳(60V 90 min), 溴乙锭显色, 在紫外线观测仪下观察结果. TNF-308 G/G野生型纯合子的PCR产物被内切酶NcoI完全切断, 形成 87 bp及 20 bp两条片段. TNF-308G/A突变型杂合子的PCR产物仅部分被切断, 形成107 bp、87 bp及 20 bp三条片段, TNFα 308 A/A突变型纯合子的PCR产物因不被切断仅形成 107 bp一个片段(20 bp片段分子量较小, 电泳时隐入引物带(图1).

图1
图1 TNF-α-308G/A基因多态性PCR-RFLP电泳分析. 1, 3: 野生型纯合子, 2: 突变型杂合子, 4: 突变型纯合子, M: DNA Marker.

统计学处理 在本组中国汉族人中未见TNF-308 A/A突变纯合子个体, 因此在基因型间各临床变量比较时仅将基因型分为TNF-αG/G纯合子及TNF-αG/A杂合子2组. 组间频率比较采用行×列表χ2检验或Fisher确切检验, 并检验等位基因在群体、性别上的分布是否符合Hardy Weinberg平衡定律. 数据处理均用美国Stata软件系统进行.

2 结果
2.1 HBV患者与健康人群间TNF-α的基因多态性

-308 G和-308 A等位基因频率在健康人分别为90.3%和9.7%, 在HBV患者分别为95.3%和4.7%, 经检验符合Hardy Weinberg平衡定律(P>0.05). 健康人及HBV患者中-308 A均为杂合子, 未能发现TNF-308 A/A突变纯合子个体. 健康人群的TNF-308 A基因频率、TNF G/A基因型频率均高于HBV患者(P<0.05). 根据第5次全国传染病与寄生虫病学术会讨论修订的"病毒性肝炎防治方案"试行标准, 我们将实验组分为急性肝炎组、慢性肝炎组和肝硬化组, 慢性肝炎组、肝硬化组与健康人群组之间TNF-308A基因频率、TNF G/A基因型频率经统计学处理有显著性差异(P<0.05). 急性肝炎组因例数较少, 未作统计学分析(表1).

表1 HBV患者与健康人TNF-α基因型及基因频率比较分析.
分组TNF-α基因型频率(%)
TNF-α基因频率(%)
nG/GG/AA/A-308G-308A
HBV患者232210(90.5)22(9.5)095.34.7
急性肝炎107(70.0)3(30.0)085.015.0
慢性肝炎146130(89.0)16(11.0)094.55.5
肝硬化7673(96.1)3(3.9)098.02.0
健康人群1033(80.6)20(19.4)090.39.7
P<0.05 vs 健康人群.
2.2 男、女间TNF-α的基因多态性比较

所有研究对象男、女间TNF-308A基因频率比较: χ2 = 0.12, P = 0.73, TNF G/A基因型比较: χ2 = 0.13, P = 0.71; HBV患者组男、女间TNF-308A基因频率比较χ2 = 0.26, P = 0.60, TNF G/A基因型比较: χ2 = 0.27, P = 0.61; 对照组男、女之间TNF-308A基因频率比较χ2 = 0.003, P = 0.95, TNF G/A基因型比较: χ2 = 0.004, P = 0.95, 以上统计资料说明男、女之间TNF-308A基因频率、TNF G/A基因型频率无显著差异.

2.3 不同HBV血清标记类型肝炎TNF-α基因型比较

根据患者HBV血清标记(HBVM)的不同, 将实验组分为大三阳组(HbsAg, HbeAg, 抗HBc均阳性)、小三阳组(HbsAg, 抗Hbe, 抗HBc阳性)、1, 5阳组(HbsAg, 抗HBc阳性)、5阳组(抗HBc阳性), 4组之间TNF-308 A基因频率经统计学处理无显著型差异(P>0.05).

2.4 不同HBV DNA PCR定量检测值肝炎TNF-α基因型比较

实验组共有166例进行了HBV DNA RT-PCR定量检测(试剂盒由安达公司提供), 将这些病例分为检测基因拷贝值>1×1013/L组和<1×1013/L组, 比较两组TNF-α基因型与基因频率, 以探讨TNF-308 A基因频率在不同HBV载量肝炎患者之间分布的差别, 结果两组之间TNF-308 A基因频率经统计学处理无显著型差异(P>0.05).

3 讨论

目前认为HBV急性感染中90%的病毒由非溶细胞机制清除, TNF-α可以选择性地加速HBV mRNA的降解, 抑制HBV基因的表达和复制而不损伤肝实质细胞[11-12]. 因而TNF-α表达不足可能是引起HBV病毒感染慢性化的重要因素之一[13-15]. Louis et al发现TNF-308 G/A突变杂合体的TNF-α产量比TNF-308 G/G野生纯合体高(平均值分别为929 ng/L和521 ng/L, P<0.05); 另外几个实验也显示TNF-308 G→A单碱基突变可能与TNF-α高表达有关[16-17]. 我们研究结果显示, 实验组TNF-308 A等位基因频率明显低于健康对照组, 即TNF-308 A等位基因与HBV感染呈负相关. 进一步比较不同临床类型乙型肝炎, 发现肝硬化组明显低于其他各组(P<0.01), 并且肝硬化组<慢性肝炎组<健康对照组, 提示TNF -308 A等位基因可能与阻止HBV感染及慢性化有关. Hohler et al对德国白种人群的研究结果表明, TNF-308 A的基因频率在HBV患者与健康人群中分别为19.0%(27/142)和16.2%(32/198), 未能发现两组之间的差异[18-19]. Fong et al研究了89名新加坡健康华人, TNF-308 A等位基因频率为11.8%(21/178)[20], 与本结果(9.71%)相比无显著差异(P>0.05). 我们与Hohler的研究结果不同, 其原因可能是种族、对照组选择及标本量不同, 本研究实验组232例, Hohler的实验是71例.

我们比较分析了TNF-308 A等位基因频率在不同HBV血清标记类型及不同HBV DNA定量检测值肝炎患者中的分布, 各组间无显著性差异, 是否提示乙肝患者HBV血清标记类型及体内病毒载量与TNF-308 G→A单碱基突变可能无关尚需进一步研究. 必须指出的是, HBV DNA定量检测值与血清HBV含量并不呈绝对的线性相关, 因为系统误差可使定量检测值相差2-4倍. 因此, 在今后的研究中, 应采用更精确的方法测定病毒载量, 以更准确地探讨TNF-308 G→A单碱基突变与不同HBV载量肝炎患者之间的相关性. 总之, 在本研究中, HBV患者的TNF-308 A基因频率显著低于健康人群, 提示TNF-308 A等位基因可能与HBV感染呈负相关. 由于TNF-α因位于具有高度多态性的MHC Ⅲ类抗原基因区, 同HLA基因或其他基因之间是否存在连锁不平衡尚有争论, 这一标记究竟是单独发挥作用还是与其他致病或易感基因连锁并协同其他基因发挥作用尚不清楚[21-22].

编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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