| 100023 北京市2345信箱 | 世界华人消化杂志 2000年3月15日;8(3):310-313 |
| Email: wcjd@public.bta.net.cn | 世界华人消化杂志 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R |
| http:// www.wjgnet.com | 版权归世界胃肠病学杂志社 |
⊙研究原著⊙
土贝母水提物对体外培养人肝癌细胞增殖及代谢的影响
姜世明1 肖正明1 宋景贵2 徐朝晖1 马树利1
1 山东师范大学生物系
山东省济南市
250014
2 山东中医药大学附属医院外科
山东省济南市
250014
姜世明，男，1961-11-26生，山东省招远市人，汉族.
1982年山东师范大学毕业，1985年山东师范大学硕士，副教授，德国海得堡大学在读博士，发表论文30篇.
山东省教委资助课题，No.J97K01
项目负责人 姜世明，250014，山东省济南市文化东路88号，山东师范大学生物系.
Supported by the Fund for Scientific Research by the Educational Committee of
Shandong Province.
Correspondence to Shi-Ming Jiang, Department of Biology, Shandong
Normal University, 88 Wenhua Donglu, Jinan 250014,
Shandong Province, China
Email. S.Jiang@DKFZ-Heidelberg.de
Tel.
0086-531-2962645
收稿日期 1999-09-22
接收日期
1999-11-15
Effects of BPF extracts on proliferation and
mitochondria metabolism of human
hepatoma SMMC-7721 cells
Shi-Ming Jiang1, Zheng-Ming Xiao1,
Jing-Gui Song2, Zhao-Hui Xu1 and Shu-Li Ma1
1 Department of Biology,
Shandong Normal University, Jinan 250014, Shandong
Province, China
2 Department of Surgery
Teaching Hospital of Shandong College of Traditional Chinese Medicine,
Jinan 250011, Shandong Province, China
Abstract
AIM To demonstrate the effects of the extracts from traditional Chinese medicine
Bolbostemma paniculatum
(Maxim) Franquet (BPF) on the proliferation and mitochondria metabolism of human hepatoma
SMMC-7721 cells.
METHODS The
dried BPF was ground to powder, extracted in cold distilled water and centrifuged to discard the pellet
and the BPF supernatant was concentrated
and lyophilized. After the dose-dependent experiments, human hepatoma cells were
treated with 200mg/L
BPF extract for 48h and mitochondria metabolism
activity was detected by MTT method.BPF extracts could significantly decrease the
activity of mitochondria metabolism,
the A570 absorption in BPF treatment group was only 31.3% of that in control
group after 48h
treatment and 21.4% after 72h treatment; after 24h
treatment with BPF, the cell numbers in experimental group were 0.57，0.316，0.29，0.285，0.57，1.287
and 1.2，in control group were 1.82， 3.67，
6.2，
9.4，
10.1 and 11， 9 and in the NON group were 1.7， 3.35，
5.6，
8.4，
8.9，
9.3 and 7.6. The numbers were not only lower than that in control group but also
than that before treatment and maintained lower than that before treatment in
the whole treatment (7d) (P＜0.01);
the cell numbers did not significantly increase after the cells were
treated for 24h and then replaced by culture in normal media for 96h.
CONCLUSION BPF
extracts could inhibit the
proliferation and mitochondria metabolism activity of human hepatoma
cells.
Subject headings
Bolbostemma paniculatum;
hepatoma; SMMC-7721;(Maxim) Franquet (BPF);
proliferation, mitochondria, MTT
Jiang SM, Xiao ZM, Song JG, Xu ZH, Ma SL. Effects of
BPF extracts on proliferation and mitochondria metabolism of human hepatoma
SMMC-7721 cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2000;8(3):310-313
摘要
目的
研究中药土贝母(BPF)水提物对体外培养的人肝癌细胞的抑癌活性.
方法
BPF经粉碎、浸提、超速离心、减压浓缩、冷冻干燥得BPF水提物.人肝癌SMMC-7721细胞经BPF提取物处理不同时间后以MTT法测其对人肝癌细胞线粒体代谢活性的影响,以细胞记数法观察了其对细胞增殖的影响.
结果
①经200mg/LBPF提取物处理48h,人肝癌SMMC-7721细胞线粒体活性为对照组的31.3%,处理72h为21.4%;②以100mg/LBPF提取物处理7d中,人肝癌细胞数分别为0.57,0.316,0.29,
0.285,0.57,1.287,1.2,对照FCS组分别为1.82,3.67,6.2,9.4,10.1,11,9,NON组分别为1.7,3.35,5.6,8.4,8.9,9.3,7.6,实验组人肝癌细胞数不仅低于对照组,而且低于处理前细胞数(P<0.01);③经BPF提取物处理24h后,即使更换为正常培养基,人肝癌细胞数在96h的恢复培养中基本无增加.
结论
中药BPF提取物能显著抑制体外培养的肝癌细胞增殖和降低线粒体代谢活性.
主题词 土贝母;肝癌;SMMC-7721;MTT;细胞增殖;线粒体
姜世明, 肖正明, 宋景贵,徐朝晖,马树利.土贝母水提物对体外培养人肝癌细胞增殖及代谢的影响.世界华人消化杂志，
2000;8(3):310-313
0 引言
中药土贝母为葫芦科植物土贝母〔Bolbostemma paniculatum
(Maxim). Franquet, BPF〕的干燥块茎. 其味苦、微寒，具散结祛痰、消肿、解毒清热之功效［1-3］.
几个世纪以来，从古至今人们用它来治疗乳岩、乳痈、乳腺增生、皮肤疣、单纯疱疹等各种疾病［2-4］. 由于它的毒副作用小，人们除了继续沿用古人的方剂外，还试图分离提取其有效成分，用于各种疾病的治疗及研究其作用机制［4，5］.
研究结果表明BPF提取物具有有效的抗肿瘤活性及低毒性［6-9］，对小鼠S-180实体瘤和U14，H22肿瘤有明显的抑制作用［7］，其水煎剂对小鼠实验诱发宫颈癌有明显的抑制作用［9］.
马润娣、于立坚et
al［10-13］报道土贝母皂甙甲素对诱发鼠耳水肿有抑制作用，可完全抑制激癌小鼠皮肤肿瘤的发生，具抑制促癌剂的作用，而且口服与局部用药同样有效. 可抑制TPA对3H掺入细胞磷脂的增强作用.
苏华et
al［14］用土贝母皂甙作为阴道杀精子剂，效果明显. 于立坚et
al［15］从土贝母中分离出的一种三萜皂甙既抑制人免疫缺陷病毒核心蛋白P24的产生，也抑制该蛋白病毒介导的细胞病变. 白月辉et al［16］的实验表明土贝母提取物结晶E能诱导HL-60细胞向类似成熟中性粒细胞方向分化. 黄文玉et
al［17］报道土贝母水煎液对小鼠吞噬细胞的吞噬功能有一定作用，但显著性差. 但是，尚未见BPF提取物对体外培养的癌细胞直接作用的研究报道. 为进一步探讨BPF对癌细胞影响的机制，我们以体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞为材料研究了BPF提取物对该细胞株的增殖和线粒体代谢的影响，以期为BPF抗癌机制提供资料.
1 材料和方法
1.1 材料 中药BPF由山东中医药大学附属医院提供，高速粉碎后的BPF，按一定比例加入DW；4℃搅拌浸提过夜，3500r/min离心20min，上清液减压浓缩至原体积的1/10，20000r/min离心30min，上清液冰冻干燥得淡黄色BPF提取物.
BPF提取物得率为271mg/g干重BPF. 人肝癌SMMC-7721细胞株引自中国科学院上海细胞库；RPMI
1640培养液为美国Gibco公司产品；胰蛋白酶为Sigam公司产品；48，96孔培养板为丹麦Nune公司产品；MTT为Fluka公司产品；CO2培养箱为日本池本理化株式会社产品；真空冰冻干燥机为日本Yamata公司产品；蛋白-核酸分析仪、超速离心机为美国Beckman公司产品；电子天平为德国Satouris产品.
1.2 方法
按文献［18-22］方法并加以改进.
1.2.1 BPF提取物浓度依赖实验
取对数生长期的人肝癌SMMC-7721细胞. 用含100mL/L小牛血清(FCS)的RPMI
1640培养液调细胞密度为4×108/L，接种于96孔培养板中，每孔200μL，37℃，50mL/L CO2孵育箱中培养24h，弃培养液，RPMI
1640漂洗细胞.
实验组每孔加入含终质量浓度分别为50，100，200，300，400，500mg/L BPF提取物的RPMI 1640，每一浓度设4个重复，对照一组加入RPMI
1640，对照二组加入含100mL/L FCS的RPMI 1640，每组均设4个重复，继续培养44h后每孔加20μL
MTT，再培养4h，弃上清液，每孔加入100μL 二甲基亚砜(DMSO)，微量振荡器上振荡至MTT完全溶解. 蛋白-核酸分析仪于570nm处测吸光度A，并将所测数据进行统计处理.
1.2.2 BPF提取物对人肝癌细胞线粒体代谢的影响
人肝癌细胞调密度为1.4×108/L接种于3个96孔培养板中培养24h后，实验组每孔换入200mg/L BPF提取物的RPMI
1640，两组对照设置同上，每组均设5个重复. 分别培养20，44，68h后，每孔加入20μL MTT，以后步骤同上. 另接种于4个96孔培养板中培养24h后，实验组每孔换入含终浓度200mg/L
BPF提取物的RPMI 1640，两组对照设置同上，每组均设5个重复.
继续培养，其中板Ⅰ于培养20h后，每孔加入20μL MTT，另外Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ板于培养24h后，弃全部上清液，换入正常含100mL/L FCS培养液，继续培养20，44，68h后，每孔加入20μL MTT，以后步骤同上.
1.2.3 BPF提取物对人肝癌细胞增殖的影响
人肝癌细胞调密度为7×107/L接种于7个48孔培养板中培养24h后，实验组每孔换入含终浓度为100mg/L BPF提取物的RPMI
1640，两组对照设置同上，每组均设3个重复. 分别培养1，2，3，4，5，6，7d，trypain blue染色后血细胞计数器上计细胞总数及活细胞数. 每孔重复计数4次，每组计数12次取其平均值. 连续计数7d，绘制生长曲线. 另接种于5个48孔培养板中培养24h后，实验组换入含终浓度为100mg/L BPF提取物的RPMI 1640，两组对照设置同上，每组均设3个重复.
继续培养24h后，换入含100mg/L FCS的RPMI
1640，分别于继续培养0，24，48，72，96h，计数细胞总数和成活率.
2 结果
2.1 BPF提取物对线粒体代谢的浓度依赖实验
不同浓度BPF提取物对人肝癌SMMC-7721细胞线粒体活性的影响呈明显的负相关(图1).
经BPF处理48h(50～100)mg/L BPF浓度组其线粒体活性与对照相比无显著差异；在200mg/L～300mg/L
BPF浓度范围内，线粒体活性明显低于对照组(P＜0.01)，且随BPF浓度增加线粒体活性逐渐降低；而高于300mg/L，再增高BPF浓度也不再继续降低线粒体活性.
2.2 BPF提取物对线粒体代谢的影响
人肝癌细胞经200mg/L BPF处理不同时间，其线粒体活性表现出时间依赖效应(图2). BPF处理24h其线粒体活性与对照组相比无显著差异. 处理48h线粒体活性为对照组的31.3%，处理72h为对照组的21.4%.经200mg/L BPF处理人肝癌细胞24h后，细胞在正常含100mL/L
FCS的RPMI 1640培养液中恢复培养，其线粒体活性与对照组相比显著降低(P＜0.01)；恢复培养24h线粒体活性仅为对照组的19.9%，48h为30.3%，72h为35.6%(图3).
2.3 BPF提取物对细胞增殖的影响
BPF提取物处理24h后，细胞数目不仅明显低于对照组(P＜0.01)，而且明显低于处理前的细胞浓度，48h细胞数降到对照组的8.6%. 5d后，细胞数虽有上升，但仍低于处理前的细胞数(图4).经100mg/L BPF提取物处理人肝癌细胞24h后，人肝癌细胞数目明显降低；在96h的恢复培养中，BPF处理组的细胞数没有明显增加(图5).
图1 不同质量浓度BPF提取物对人肝癌SMMC-7721细胞线粒体代谢的影响.
图2 BPF提取物对人肝癌细胞线粒体代谢的时间依赖性.
图3 BPF处理24h后对恢复过程中线粒体活性的影响.
图4 BPF提取物对人肝癌细胞生长曲线的影响.
图5 BPF提取物处理24h后对恢复过程中肝癌细胞生长的影响.
3 讨论
我们采用低温水浸提，超速离心去沉淀后，上清液冷冻干燥得到的淡黄色粉状提取物，极易溶于水. 因未经高温水煎工艺，其成分应不同于水煎剂，更不同于醇萃取物. 该低温水提物对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖和线粒体代谢有明显的抑制作用.
人肝癌SMMC-7721细胞经BPF水提物处理24h，细胞数明显降低，仅为FCS对照组的31.3%，为处理前细胞数的40.7%. 计数细胞前，相差显微镜下BPF处理组的人肝癌细胞折光率增高，部分细胞已呈解体状. 这说明BPF水提物能导致人肝癌SMMC-7721细胞死亡，这一结果与文献报道的BPF作用相符.
而不同于王永清et al［23］、姜树山et
al［24］的报道.
并且人肝癌细胞经BPF提取物处理24h后，再换入正常含100mL/L FCS的培养基中，细胞数在96h内没有明显增加，这说明经BPF提取物短时处理即可在较长时间内抑制细胞分裂. 其机制有待进一步研究. BPF提取物对线粒体活性影响在24h时，其A570光吸收与对照组没有明显差异. 我们认为虽然经BPF提取物处理24h后引起细胞死亡，但此时死亡细胞仍呈贴壁状态，其线粒体仍然具有活性，能进行成色反应，而造成光吸收差异的不显著. 但是细胞经BPF提取物处理48h和72h时死亡细胞大部分都已解体，此时的线粒体活性应为活细胞的活性. 这也提示用MTT法测定细胞增殖时的局限性，它不能代替
3H-TdR掺入法和细胞计数法.
由以上结果我们可以得出如下结论：BPF水提物能引起体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞死亡，经BPF提取物(100mg/L)处理24h后，96h的恢复培养中仍能明显抑制细胞增殖和降低线粒体活性.