⊙研究论文⊙

rhIFN-αb和苦味叶下珠提取物对人肝癌细胞株

PLC/PRF/5产生HBsAg的影响

纪徐淮,秦一中,汪伟业,朱建英,许国铭

第二军医大学长海医院 上海市 200433
项目负责人:纪徐淮
收稿日期:1994-08-08 接受日期:1994-09-24

Effects of rhIFN-αb and extracts of phyllanthus urinaria L. on HBsAg production in PLC/PRF/5 cell line

Xu-Huai Ji, Yi-Zhong Qing, Wei-Ye Wang, Jian-Ying Zhu and Guo-Ming Xu
Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433 China

Abstract
AIMS To investigate the therapeutic effect of drugs onchronic hepatitis B virus infection.

METHODS Effects of rhIFN-αb and extracts of phyllanthus urinaria L. on HBsAg production in PLC/PRF/5 human hepatoma cell line were in vestigated in vitro.

RESULTS Decreased HBsAg production was regularly demonstrated 48h  after the treatment of cells with 50-250IU/mL of  rhIFN-αb and 2-4mg/mL phyllanthus urinaria L, especially combining IFN with 10^-5mol/L Ara-A. Treatment of PLC/PRF/5 cells with hydrocortisone acetate (10^-3mol/L) and Ara-A(10^-5mol/L) greatly stimulated HBsAg production. The decrease of extracellular HBsAg excretion seemed to be due to inhibition of intracellular HBsAg formation.

CONCLUSIONS Interferon alfa, in combination with DNA synthesis inhibitors may decrease the HBsAg formation in PLC/PRF/5 cells and a crudeextracts from phyllanthus urinaria L. can also inhibit the HBsAg formation. This cell line is a convenient model for deeper studies of chemotherapy of chronically HBV carriers.

Keywords interferon Ara-Ahepatoma cell hepatitis B virus-phyllanthus urinaria L

Ji XH, Qing YZ, Wang WY, Zhu JY,Xu GM.Effects of rhIFN-αb and extracts of phyllanthus urinaria L. on HBsAg production in PLC/PRF/5 cell line. Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1995；3(3)：136-138

摘要
目的 体外研究药物消除HBsAg的作用，建立体外筛选HBsAg阴转的实验方法.

方法 观察人重组干扰素α和苦味叶下珠提取物对人肝癌细胞株PLC/PRF/5产生HBsAg的影响.

结果 α干扰素主要影响该细胞对HBsAg的合成而抑制其产生HBsAg.干扰素与阿糖腺苷联合使用可增强对HBsAg合成的抑制作用.不同浓度的苦味叶下珠提取物对PLC/PRF/5细胞产生HBsAg有不同的影响，较大剂量有较明显的抑制作用，使该细胞株合成HBsAg受抑制，但尚不能除外其与HBsAg特异性结合的可能.

结论 人重组干扰素α和苦味叶下珠在体外均可抑制PLC/PRF/5细胞合成HBsAg.

关键词 干扰素;叶下珠;人肝癌细胞;乙肝表面抗原

纪徐淮,秦一中,汪伟业,朱建英,许国铭.rhIFN-αb和苦味叶下珠提取物对人肝癌细胞株PLC/PRF/5产生HBsAg的影响.
新消化病学杂志，1995；3(3)：136-138


人肝细胞是HBV的自然靶细胞，但肝细胞培养困难，其功能只能维持很短时间，且转染HBV的成功率甚低，难以推广应用.人肝癌细胞株PLC/PRF/5是自然整合有HBV的一株细胞，可分泌HBsAg，观察不同药物对该细胞系产生HBsAg的影响，可筛选HBV感染的治疗药物.本实验系统易于操作，是研究慢性HBV感染化疗的较方便的体外模型.本文观察了叶下珠提取物对该细胞株产生HBsAg的影响.

1 材料和方法

1.1 细胞株 PLC/PRF/5细胞株来自上海医科大学微生物学教研室. 将该细胞株复苏后置入RPMI 1640培养基(Gibco)中，加入10%热灭活的胎牛血清(Gibco)及抗生素(青霉素100U/mL,链霉素100U/mL)置37，5%CO₂及95%湿度下培养.

1.2 试剂 人重组干扰素αb (rhIFN-αb) 为无色透明注射液，批号09001；pH 7；效价10⁹IU/ml；比活性10⁹IU/mL·P；蛋白浓度1.13mg/mL,由第二军医大学分子遗传学教研室提供.试验时将其溶解在RPMI1640培养基中，并分别稀释制成终浓度为50IU/mL及250IU/ml的溶液.②苦味叶下珠水溶液浸出物：将苦味叶下珠(phyllanthus urinaria L.)全草4g碾碎后加入20mL去离子水，在60 条件下周期振荡2h，然后用尼龙网过滤，滤过液在室温下8000g离心1h，其上清液通过0.45μm的微孔滤膜除菌后供体外实验，使用时用RPMI 1640培养液分别制成0.1，1，2，4mg/mL的浓度.阿糖腺苷(Ara-A)溶解于RPMI 1640培养基中，并将其分别稀释成10^-4mol/L及10^-5mol/L的浓度，置4℃冰箱内2周后备用.醋酸氢化可的松溶解于RPMI 1640培养基中，稀释成10^-5mol/L的浓度，置4冰箱内2周后备用.

1.3 HBsAg的测定 HBsAg的检测采用ELISA试剂盒，并用酶联检测仪测定其吸光度值(OD值).

1.4 细胞抽提物的制备 将经药物处理过的细胞与对照细胞置于Dounce匀浆器中进行匀化处理，制成匀浆后用15000r/min离心30min，再分别测定上清液与细胞碎片中胞浆内HBsAg含量.

2 结果

2.1 将PLC/PRF/5细胞置于15cm²培养瓶中进行培养，每瓶接种的细胞数为1×10⁶个细胞，每24h更换1次新鲜培养液.不同浓度的药物对PLC/PRF/5细胞产生HBsAg的影响详见图1.结果表明，50与250IU/mL浓度的rhIFN-αb均有明显抑制HBsAg产生的作用，且剂量越大其抑制作用越明显，而IFN-αb联合应用Ara-A时其抑制作用更强.苦味叶下珠提取物对PLC/PRF/5细胞产生HBsAg的影响与其浓度密切相关，较小剂量(1mg/mL以下)影响不大，而较大剂量(4mg/mL)则有明显的抑制作用.而10^-3mol/L的醋酸氢化可的松联用10^-5mol/L的Ara-A则可明显促进HBsAg的分泌.rhIFN-αb与苦味叶下珠的抑制作用均在给药后48h最明显.用0.2%台盼蓝生理盐水溶液与待测细胞悬液等量混合，置于血细胞计数板下计数活细胞，发现上述剂量的药物处理后测得活细胞百分率始终＞90%.

图1 药物对PLC/PRF/5细胞外HBsAg含量的影响［○：对照；●:氢化可的松(10^-3mol/L)+Ara-A(10^-5mol/L);▲:rhIFN-αb (50IU/mL);:rhI FN-αb(250IU/mL);+:Ara-A(10^-5mol/L);■:rhIFN-αb(250IU/mL);:P.Urinaa L.(4mg/mL)］

2.2 Ara-A对PLC/PRF/5细胞的毒性 将细胞按5×10⁵个/mL的浓度接种于培养瓶中，培养24h后分别加入10^-4,10^-5mol/L的Ara-A，结果发现10^-4mol/L的Ara-A对PLC/PRF/5细胞有明显的毒性作用，加药24h即可见细胞肿胀，细胞内颗粒增多，培养72h后细胞基本死亡(台盼蓝染色示95%的细胞为亲染细胞).而10^-5mol/L的Ara-A虽对PLC/PRF/5细胞有抑制作用，但仍能维持细胞的完整性，且对HBsAg的影响不大，详见图2.

图2 Ara-A对HBsAg产生的影响［▲:Ara-A(10^-5mol/L); ○:Ara-A(10^-4mol/L);●：对照；↑: 为Ara-A加入时刻］
图3 苦味叶下珠(4mg/mL)对PLC/PRF/5细胞内外HBsAg含量的影响［●:细胞外HBsAg含量；:细胞内上清液中的HBsAg含量；:细胞内细胞碎片中的HBsAg含量］

2.3 rhIFN-αb与苦味叶下珠提取物的作用 为阐明抑制PLC/PRF/5细胞合成HBsAg还是抑制其释放出细胞，我们将各有关处理组织细胞在培养的不同阶段制备细胞抽取物，分别比较细胞内与细胞外HBsAg的含量，详见图3.结果表明，PLC/PRF/5细胞外HBsAg含量的改变与其细胞内HBsAg含量的变化密切相关，提示rhIFN-αb与苦味叶下珠提取物使PLC/PRF/5细胞株分泌HBsAg减少与HBsAg的合成受到抑制有关.当然尚不能除外苦味叶下珠提取物与HBsAg特异性结合的可能.同样，醋酸氢化可的松联用阿糖腺苷促进PLC/PRF/5细胞产生HBsAg是由于该细胞对HBsAg合成增加有关.

3 讨论

在抗HBV感染的治疗药物中，rhIFN效价高，毒副作用低，治疗效果肯定.但干扰素临床抗病毒疗效远远落后于动物模拟试验及理论上的抗病毒机制，且各地报道干扰素的治疗效果差别较大，有些研究者发现使用IFN-α联合应用DNA合成抑制剂或免疫功能抑制剂治疗HBV感染，可以提高疗效_［1］.DNA合成抑制剂使用后可产生短时间的免疫抑制而增强干扰素的作用效果^［3］.DNA合成抑制剂亦增强了氢化可的松的作用效果，促进了细胞与病毒DNA向RNA的转录过程^［3］.IFN-α主要作用于RNA水平，其主要价值在于可阻止病毒转移播散.本研究结果表明，IFN-α 对PLC/PRF/5细胞产生HBsAg的抑制作用主要是影响了宿主对HBsAg的合成.叶下珠属草本植物，盛产于我国东南地区及印度等国，传统将其广泛用于黄疸及其他疾病^［4］.由于近年来有报道它的粗提物可治愈某些慢性HBV感染者，尤其是HBsAg携带者，且无任何毒副作用，而不断得到重视与深入的研究^［5］.作者曾用昆明株小白鼠及Wistar大白鼠观察叶下珠的急性毒性作用，发现其LD₅₀为推荐成人用量的500倍以上，且对四氯化碳、硫代乙酰胺引起的肝损害有一定的保护作用.Ventateswaram ^［6］用该药观察其对土拔鼠肝炎病毒(WHV)的影响，发现它在体内及体外均可抑制WHV的复制并能减轻WHV对土拔鼠的肝病理损害，并推测该药对其他嗜肝病毒感染有类似抑制作用，同时认为苦味叶下珠中可能含有两种活性片断即DNA多聚酶抑制活性片断与HBV表面抗原结合活性片断.我们的实验结果尚提示叶下珠对PLC/PRF/5细胞合成HBsAg有一定的抑制作用并与用药剂量有关，这与临床报道是一致的^［7］.Blunberg在对苦味叶下珠进行的临床研究中，观察了79例HBV携带者，随机分成治疗组与对照组，治疗组给予200mg苦味叶下珠全草的干燥粉末，3次/d，服用30d时停药.结果表明，30d后HBsAg阴转并持续9个月阴性者治疗组占59%(23/37)，对照组仅为4%(1/23).对个别持续HBsAg阳性者可给予更长时间的治疗.HBsAg阳性携带者至少要经本品治疗6个月(剂量加大至500mg，3次/d)的长程治疗后才能获得较好效果.但本品的疗效与产地、品种和采集季节密切相关.叶下珠对PLC/PRF/5细胞产生HBsAg的抑制作用机制尚不清楚，可能包括两个方面，一是叶下珠对HBsAg合成的抑制作用，具体作用部位不明，有待于进一步研究，我们的实验结果支持这一论点；二是叶下珠的某个活性成分与PLC/PRF/5分泌的HBsAg特异性结合的结果.

4 参考文献
1 Davis CL, Hoofnagle JH. Interferon in viral hepatitis: role in pathogenesis and treatment.
  Hepatology, 1986;6(8):1038-1041
2 Mason WS, Taylor JM. Experimental systems for the study of hepatic virus and hepatitis delta
  virus infections. Hepatology, 1989;9(4):635-639
3 Clementi M, Bagnarelli P. Effect of steroids and adenine-arabioside (Ara-A)on growth and HBsAg
  production of human hepatoma cell line. Arch Virol,1983;75(1):137-141
4 Thagarajan SP, Subramanian S, Thirunalasundari T, et al. Effect of phyllanthus amarus on chronic
  carriers of hepatitis B virus. Lancet,1988;2(8614):764-766
5 纪徐淮，秦一中，汪伟业，等.苦味叶下珠提取物对人肝癌细胞株PLC/PRF/5产生HBsAg的影响.
  中国中药杂志，1993；(8)：496-498
6 VenRateswaran PS. Effect of an extract from phyllanthus niruri: in virto and in vivo studies.
  Proc Natl Acad Sci USA, 1987; 84(1):274
7 Blumberg BS. Treatment of HBV carriers with phyllanthus amarus.Vaccine, 1990；8(Suppl):86